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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1505
-
1510
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1505
-
1510
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1508
植物的
WRKY
蛋白构建系统发育树
(
图
5)
，系统进
化关系分析表明，美洲南瓜
WRKY
与黄瓜和毛白
杨中的
WRKY
蛋白亲缘关系最近，与橡胶树等植
物中的
WRKY
蛋白亲缘关系较远。
图
5
植物中
WRKY
蛋白的系统发育树
注
: 1:
橡胶树
(AEE81757); 2:
大豆
(ABY84663); 3:
苜蓿
(AES77535); 4:
陆地绵
(ADI52618); 5:
蓖麻
(EEF50803); 6:
泥糊菜
(EFH66291); 7:
拟南芥
(AAL13048); 8:
小麦
(ACD-
80361); 9:
毛白杨
(ACV92032); 10:
美洲南瓜
(JXO96811);
11:
黄瓜
(ADU52501); 12:
甘蓝型油菜
(ACI14396); 13:
水稻
(ABC02814); 14:
玉米
(ACG42925)
Figure 5 Phylogenetic tree of WRKY protein in plants
Note: 1:
Hevea brasiliensis
(AEE81757); 2:
Glycine max
(AB-
Y84663); 3:
Medicago truncatula
(AES77535); 4:
Gossypium
hirsutum
(ADI52618); 5:
Ricinus communis
(EEF50803); 6:
Lyrata
(EFH66291); 7:
Arabidopsis thaliana
(AAL13048); 8:
Triticum aestivum
(ACD80361); 9:
Populus tomentosa
(AC-
V92032); 10:
Zucchini WRKY4
(JXO96811); 11:
Cucumis
sativus
(ADU52501); 12:
Brassica napus
(ACI14396); 13:
Ory-
za sativa
(ABC02814); 14:
Zea mays
(ACG42925)
2
讨论
植物在长期进化过程中，形成了一系列防卫机
制，以抵御和适应各种生物及非生物胁迫。
WRKY
转录因子在植物的逆境胁迫信号转导过程起着重
要作用
(
李淑敏等
, 2008)
。
WRKY
基因最早在甜薯中
被发现，之后在野燕麦、皱叶欧芹、拟南芥、烟草
中相继被发现
(Eulgem and Somssich, 2007)
。不同植
物
WRKY
蛋白序列分析表明，
WRKY
蛋白在氨基酸
序列上有一定保守性，进而揭示了它们在生物学功
能上也有一定的相似性。随着更多的
WRKY
蛋白在
不同物种中的发现，越来越多的证据表明
WRKY
转
录因子对植物的生长发育及胁迫反应有着相当重
要的作用。
目前，在发表的文章中还没有发现有关南瓜
WRKY
家族成员的信息。本文首次从南瓜类植物中
克隆到
WRKY
家族成员
WRKY4
，填补了在南瓜
WRKY
家族成员报道上的空白。对南瓜
WRKY4
全
序列进行初步分析，表明南瓜
WRKY4
含有两个
WRKY
保守域，属于最古老的
WRKY
家族成员之一。
南瓜
WRKY4
的获得，为进一步研究其在南瓜中的作
用机制奠定了基础，同时可以利用其同源性，研究南
瓜与其他植物的进化关系。本实验后续工作，利用
荧光定量
PCR
进一步分析确定其在水杨酸胁迫下，
WRKY4
基因在南瓜中的表达。目前
WRKY
转录因子
的研究主要集中在基因克隆，表达及相关功能分析
等方面，而对其参与的植物胁迫应答过程并不清
楚，
WRKY
转录因子在植物中抗逆信号的转导途径
也有待进一步分析研究。随着转录研究的不断深入
和分子生物学水平的不断提高，人们对
WRKY
家族
的作用机理及其相关功能将会逐步了解。
3
材料与方法
3.1
试材与主要试剂
美洲南瓜
(
Cucurbita pepo
)
种子由北京农学院蔬
菜育种课题组提供。供试材料于
2011
年种植于北
京农学院温室大棚，选取两片子叶充分展开的植
株，用液氮速冻后于-
80
℃冰箱保存备用。总
RNA
抽提试剂盒以及
DNA
胶回收试剂盒购于上海生工
生物工程有限公司；
M-MLV
反转录酶、连接载体
PMD19
-
T Vector
和
RACE
试剂盒购于大连宝生物
工程有限公司；大肠杆菌
DH5α
购于北京天根生化
科技有限公司。
3.2 RNA
提取和
cDNA
合成
采用
UNIQ
-
10
柱式
Trizol
试剂盒提取总
RNA
，
利用
DNase
Ⅰ
(TaKaRa)
除去总
RNA
中混有的少量
DNA
，用去蛋白液
RW1 (
博迈德
)
除去总
RNA
中的
蛋白，用
1%
的琼脂糖凝胶电泳检测总
RNA
的完整
性。
cDNA
合成体系体积为
20 μL
，过程为：总
RNA
与
50 μmol/L Oligo(dT) 18
混合液于
70
℃水浴
10 min
；
再加入
M-MLV
反转录酶
(200 U)
、
dNTP (10 mmol/L)
、
RNase
抑制剂
(40 U)
及灭菌的双蒸水，置于
42
℃水浴
60 min
；最后置于
70
℃变性
15 min
。
3.3
WRKY4
基因中间片段的克隆
根据已报道的黄瓜
WRKY4
基因序列的保守区
域设计一对特异性引物
P1
和
P2 (
表
1)
，以总
RNA
反转录得到的
cDNA
为模板，进行
RT-PCR
。
20 μL