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分子植物育种(网络版), 2012 年, 第 10 卷, 第 1505-1510 页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1505-1510
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年前的真核生物( 余迪求等, 2006)。
WRKY 转录因子能够广泛参与植物的生物与非
生物的胁迫反应，对研究植物抗性具有重要价值。
WRKY 转录因子在转录调控中可作为转录激活子或
抑制子发挥作用(Xie et al., 2005; Zhang et al., 2004)。
研究表明，WRKY 基因属于诱导型基因，可被多种
环境条件诱导(Dong et al., 2003) 。如拟南芥中
WRKY3 和 WRKY4 编码两个结构相似的 WRKY 转录
因子，它们可被病菌和水杨酸诱导(Lai et al., 2008)；
烟草 NtWRKY4 可明显被水杨酸诱导，但逆境胁迫
对其诱导不明显。250 mmol/L NaCl 盐胁迫和 20%
PEG6000 干旱胁迫同时诱导 GhWRKY4 的基因表
达( 张娜等, 2012)。利用 RNAi 干扰技术，研究发现
烟草 WRKY4 转录因子在叶片生长和生物胁迫方面
具有重要作用，这在 WRKY 家族成员中是很少见的
(Ren et al., 2010)。
目前，还没有发现关于南瓜 WRKY 基因家族成
员的报道，本文通过克隆美洲南瓜 WRKY4 ，并对其
全序列进行生物信息学分析，为进一步研究 WRKY4
在南瓜中的功能及作用奠定基础。
1 结果与分析
1.1 美洲南瓜总 RNA 的提取及 WRKY4 基因中间
序列的获得
提取的美洲南瓜总 RNA 经琼脂糖凝胶电泳检
测，可见 28S、18S 和 5S 三条清晰的 rRNA 条带，且
28S 条带的亮度约是 18S 条带亮度的 2 倍( 图 1)，表
明 RNA 样品完整性较好，未出现降解。经紫外分光
光度计测定，A260nm/A280nm 比值在 1.8~2.0 之间，表明
RNA 纯度较高，无 DNA 和蛋白污染。
图 1 美洲南瓜总 RNA
注: M: DL2000 marker; 1: 总 RNA
Figure 1 Total RNA from Zucchini
Note: M: DL2000 marker; 1: Total RNA
根据 GenBank 上已提交的黄瓜 WRKY4 基因序
列保守区域设计特异性引物 P1 和 P2，以美洲南瓜
cDNA 为模板，扩增得到一个大约 500 bp 的特异性
产物，对此片段进行回收、克隆、鉴定、测序，得
到一段 497 bp 的 cDNA 序列(图 2)。经 BLAST 分析，
此序列与黄瓜 WRKY4 的同源性达到 87% ，为美洲
南瓜 WRKY4 的一段序列。
图 2 WRKY4 基因扩增产物
注: M: DL2000 marker; 1: RT-PCR 扩增产物
Figure 2 Amplified product of WRKY4
Note: M: DL2000 marker; 1: Amplifiedproducts of RT-PCR
1.2 WRKY4 基因 3'端与 5' 端的获得
根据美洲南瓜 WRKY4 基因中间序列的测序结
果设计 3'RACE 和 5'RACE 特异性引物，分别进行
巢氏 PCR，均在第二轮扩增产物中获得清晰的特
异性条带。
对扩增产物进行回收、克隆、鉴定后测序，3'R-
ACE 试验获得 543 bp 的 cDNA 片段( 图 3A)，出现的
第一个终止密码子为 TGA，3'端包含一个 105 bp 的
UTR 结构和 13 bp 的多聚腺苷(polyA) 尾。
5'RACE 试验获得 903 的 cDNA 片段 (图 3B)，
包含一个 185 bp 的 UTR 结构。
图 3 3'RACE 和 5'RACE 第二轮 PCR 扩增产物
注: M: DL2000 marker; A: 3'RACE 第二轮 PCR 扩增产物; B:
5'RACE 第二轮 PCR 扩增产物
Figure 3 Amplified product of the second round between
3'RACE and 5'RACE
Note: M: DL2000 marker; A: Amplified product of the second
round between 3'RACE; B: Amplified product of the second
round between 5'RACE