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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1497
-
1504
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1497
-
1504
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1501
图
8 BnPPR636
启动子顺式作用元件分布图
Figure 8 Distribution of CIS-acting elements in the promoter of BnPPR636
(
转录起始位点
)
，和一些转录因子结合位点，如：
GATA-box
，
WRKY710S
，
MYBPZM
等。另外还发
现一些与根有关的组织特异性元件，如
CAAT-BOX
；
与胁迫有关的元件，如
MYBCORE
；以及与光调控
相关的应答位点，如
I-BOX
。预测结果表明此序列能
代表
BnPPR636
的启动子序列信息。
2
讨论
同源克隆是基因克隆的主要方法之一，由于其
工作量小，省时省力，且针对性强，逐渐得到广泛
应用。同源克隆成败的关键在于所选用序列的保守
性。由于氨基酸序列的保守性强于核苷酸序列，
CODEHOP
方法利用氨基酸序列的保守性设计简
并引物，与利用核苷酸序列设计的简并引物相比
较，能更加有效地降低引物的简并性，从而提高特
异性。
CODEHOP
方法设计的引物分为
5'
夹板端和
3'
核心区两部分。
5'
夹板端由
20
至
30
个碱基组成，
主要对退火温度起作用，提高
PCR
的效率；
3'
核心
区由根据氨基酸序列设计的简并引物组成。在
PCR
过程中，主要由
3'
核心区引物序列与模板配对
(Liu
and Huang, 1998)
。
5'
夹板端和
3'
核心区共同作用可
以有效地增强扩增的特异性，提高基因克隆的效
率。本研究利用
CODEHOP
方法共设计了
6
条引物，
组配成
9
个引物对，仅用
1
个能很好扩增出明显片段
的引物对就获得了预期的
PPR
基因，证明了该方法
的高效性。
RACE
技术是以
PCR
为基础，利用特异引物和
通用引物相结合，快速扩增
cDNA 5'
末端和
3'
末端的
一种方法。近年来
RACE
技术得到了极快的发展，
在基因全长序列扩增中应用广泛。许多实验室都利
用
RACE
技术成功得到了基因的
cDNA
全长
(Rose et
al., 1998; Chai et al., 2010;
何聪芬等
, 2011)
。本研究
在利用
CODEHOP
简并引物扩增出目标特异片段的
基础，结合
RACE
技术在甘蓝型油菜波里马细胞质
雄性不育
(Pol CMS)
的恢复系中成功获得
BnPPR636
基因。推导的氨基酸序列分析结果证实
BnPPR636
与已经发表的一些
PPR
蛋白，特别是与甘蓝型油菜
细胞质雄性不育育性恢复基因的氨基酸序列相似
性较高，如与
Ogura CMS
恢复基因的氨基酸序列和
白菜的一个未知蛋白
ABQ50546.1
的序列相似性都较
高。其中
ABQ50546.1
是从白菜的一个对波里马
CMS
具有育性恢复性能品系的基因组文库中鉴定出来
的，与育性恢复相关的可能性较大
(Geddy and Brown,
2007)
。与拟南芥中同源性最高的
PPR
基因是
At1g-
12300 (
基因库中蛋白编号
CAR70003)
，在
1 774 bp
序列长度范围内有
1 409
个碱基是相同的，同源性高
达
79%
。
Liu
等
(2012)
通过图位克隆获得的波里马
CMS
的候选恢复基因
ORF2
也是与
At1g12300
同源
性最高。如果
BnPPR636
与
ORF2
为同一基因，则本
研究利用同源克隆获得目标基因比图位克隆简单
快速得多。但
BnPPR636
是不是恢复基因，还有待