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分子植物育种(网络版), 2012 年, 第 10 卷, 第 1458-1463 页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1458-1463
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
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确剪切，特别是识别位点的突变极易造成内含子的
剪切错误(陈县明, 2010)。本研究由转基因植株 S1- 1
形成的纯合后代株系中 AtNPR1 基因所含内含子均
不能切除，测序结果发现，RT-PCR 扩增的 853 bp
片段中，两个内含子的识别位点都没有发生突变，表
明内含子未剪切不是由识别位点突变引起，RT-PCR
除扩增出 853 bp 片段，还有表达量稍低 1 165 bp 片
段出现，测序结果显示该片段是基因重排的结果，在
重排的基因中，位于 AtNPR1 基因的 562~640 bp 和
1 377~1 484 bp 间的内含子均未出现在表达序列中，
原位于 1 689~1 798 bp 的内含子只有 1 777~1 789 bp
出现在重排基因中，失去了内含子识别的 5'ss (splice
site)序列，推测可能是该重排基因的表达干扰了
AtNPR1 基因的正常剪切，未能形成有功能的表达产
物，转基因株系的表型—纹枯病抗性未有显著提高。
3 材料与方法
3.1 植物材料
拟南芥为哥伦比亚生态型，为本实验室保存。江
苏里下河地区农科所小麦室提供扬麦 12 号转基因受
体品种，开花后 12~14 d 的小麦幼胚用于转化研究。
3.2 AtNPR1 基因的克隆及载体构建
采用 CTAB 法提取拟南芥叶片 DNA。根据 At-
NPR1 基因 DNA 序列(GenBank accession no. EF470-
723)设计 PCR 扩增引物对 AtNPR1- F：5'-acccgggC-
TGTTGATGGACACCACCATTGATGG-3' (下画线为
引入的 SmaⅠ酶切位点)和 AtNPR1-R ：5'-agagctcGC-
AAAAATTACACTAAGAGGCAAG-3' ( 下画线为
引入的 SacⅠ酶切位点) ，以提取的叶片 DNA 为模
板，采用 TaKaRa LA Taq 酶扩增 AtNPR1 基因，回收
2125 bp 的扩增片段，连接到 pGEM-T 载体 (Prome-
ga)，产生 pGEM-T-NPR1 质粒，生工生物工程 (上海)
有限公司测序，测序结果进行 Blast 验证。
采用限制性内切酶 SmaⅠ和 SacⅠ双酶切质粒
pGEM-T-NPR1，获得 AtNPR1 基因，将该基因替换质
粒 pACH25 (Christensen and Quail, 1996)中的 SmaⅠ
和 SacⅠ位点间的 gus 基因即获得表达载体 pACN-
PR1，其中玉米 Ubiquitin 组成型高表达启动子控制
AtNPR1 基因的表达，bar 基因为筛选标记基因，该
基因抗除草剂 L-PPT (L-phosphinothricin) (图 1)。
3.3 小麦转基因植株的获得
小麦转化过程中，质粒提取和包裹金粉以及基
因枪轰击的参数按周淼平等(2008) 文献略作修改。
基因枪轰击前后用 0.4 mol/L 山梨醇高渗处理幼胚
16 h ，轰击后，在未加选择压的愈伤诱导培养基(MS
基本培养基添加 2 mg/L 2,4-D)暗培 4 d 后，转入添
加 3 mg/L L-PPT 愈伤诱导培养基诱导培养 21 d，抗
性愈伤然后转入分化培养基 (MS 基本培养基添加
1 mg/L KT 和 1 mg/L NAA 以及 3 mg/L L-PPT)分化
42 d ，再生抗 L-PPT 幼苗转入生根培养基(1/2MS 添
加 3 mg/L L-PPT)，待幼苗长至 6~8 cm 长时转移至盆
钵，取叶片样品提取 DNA 用于分子检测，套袋自交
结实收获 T0 代种子。
T 0代种子播于 72 孔塑料穴盆中，萌发产生 T 1代
植株，于 2~3 叶时喷施含 100 mg/L L-PPT 有效成分
的 Basta 除草剂溶液继续筛选，根据 T1 代植株抗 Basta
的分离结果推断 T 0 代植株是否为转基因阳性植株。
3.4 转基因小麦 AtNPR1 基因的分子检测
采用 CTAB 法抽提抗 Basta 植株的叶片 DNA，
进行 AtNPR1 基因 PCR 检测，上游引物(NPR1 -F1)：
5'- GAAGGTAGAACCGCACTC-3'；下游引物(NPR-
1- R1)：5'- GTCGAATCTGTCAGGGAC-3'，预期扩
增片段为 853 bp，含 108 bp 和 110 bp 的 2 个内含子。
PCR 的总体积为 20 μL ，含 1×Buffer、 1.5 mmol/L
MgCl2、0.2 mmol/L dNTPs、0.5 μmol/L 引物、50 ng
模板 DNA、1 U Taq 酶 (TaKaRa)。PCR 条件为 95℃
先预变性 3 min；然后 94℃ 30 s ，55℃ 45 s ，72℃
45 s ，扩增 35 个循环；然后 72℃延伸 7 min 。1.0%
琼脂糖凝胶电泳检测分析扩增片段。
3.5 转基因小麦 AtNPR1 基因的表达分析
用 SV Total RNA Isolation System 试剂盒(Pro-
mega) 提取 T 5 代转基因植株叶片总 RNA，按照
Prime-Script RT-PCR 试剂盒(TaKaRa) 说明书合成
cDNA 并进行半定量 RT-PCR 分析，AtNPR1 基因扩
增引物与分子检测相同，正常表达 (切除内含子) 的
预期扩增片段为 635 bp。采用 18S rRNA 基因作为内
参基因(18S-QF: 5' -GTGACGGGTGACGGAGAAT-
T -3'; 18S-QR:5'-GACACTAATGCGCCCGGTAT-3') 。
PCR 的总体积为 25 μL，含 1×Buffer Ⅱ、0.4 mmol/L
dNTPs、0.6 μmol/L 引物、2 μL cDNA 模板、1.25 U
Ex Taq HS 酶 (TaKaRa)。PCR 程序为 95℃先预变
性 3 min；然后 94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，扩
增 30 个循环；然后 72℃延伸 7min。1.2%琼脂糖凝
胶电泳检测分析扩增片段。部分扩增产物的测序和
验证同 3.2 。