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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1458
-
1463
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1458
-
1463
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1459
键，寡聚体解离为单体，单体在
C
末端的核定位序
列引导下，在细胞核内积累，与
TGA
等转录因子发
生互作，激活下游防卫基因表达而产生抗性
(
张红志
和蔡新忠
, 2005)
。
目前，烟草
(Liu et al., 2002)
、水稻
(Chern et al.,
2005)
、棉花
(
王旭静等
, 2006)
、中间偃麦草
(
唐益苗
等
, 2007)
、苹果
(Malnoy et al., 2007)
、梨
(Che et al.,
2008)
、香蕉
(Endah et al., 2008)
、大豆
(Sandhu et al.,
2009)
、甘薯
(
陈观水等
, 2009)
、葡萄
(Henanff et al.,
2009)
、可可树
(Shi et al., 2010)
等植物中的
NPR1
基
因已经被克隆，表明
NPR1
介导的抗性途径可能是多
种植物共同保守的途径。研究发现，作物中过量表
达
NPR1
基因可以提高其对病害的抗性。例如过量表
达
NPR1
的拟南芥对细菌
Pseudomonas syringae
、真
菌
Peronospora parasitica
和
Erysiphe cichoracearum
的
抗性增加
(Cao et al., 1998; Friedrich et al., 2001)
；转
基因番茄中过量表达拟南芥
AtNPR1
表现出对病原
菌的广谱抗性
(Lin et al., 2004)
；转基因苹果过量表达
苹果
MpNPR1
对病原菌
Erwinia amylovora
、
Venturia
inaequalis
和
Gymnosporangium juniperi-virginianae
的抗性增加；单子叶植物中过量表达
AtNPR1
，同
样也会提高植物抵御病原菌的能力，在水稻中过量
表达
AtNPR1
和水稻
OsNPR1
基因都增加了对白叶枯
病菌
Xanthomonas oryzae
的抗性
(Chern et al., 2001;
2005; Yuan et al., 2007)
；在小麦中过量表达
AtNPR1
增加了对小麦赤霉病菌
Fusarium graminearum
的抵
御能力
(Makandar et al., 2006)
；表明单子叶植物与双
子叶植物可能拥有相同的
NPR1
抗病调控途径。
小麦纹枯病
(Wheat sharp eyespot)
是中国长江
流域中下游麦区和黄淮麦区的主要病害，禾谷丝核
菌
(
Rhizoctonia cerealis
Vander hoeven)
和立枯丝核
菌
(
Rhizoctonia solani
Kuhn)
是其主要病原菌，每年
造成严重的产量损失，选育和使用抗纹枯病小麦新
品种是防治该病害最经济和有效的途径。迄今为
止，尚未发现对该病害免疫的小麦品种
(
系
)
，高抗
的材料也较匮乏。研究发现，小麦纹枯病抗性是数量
性状，主基因效应不大，并且存在基因互作，给常规
育种带来诸多困难
(
蔡士宾等
, 2006)
。转基因技术由
于周期短、针对性强等优点，已经成为小麦抗纹枯
病育种的新手段
(Chen et al., 2008)
。
本研究构建了拟南芥
AtNPR1
基因的单子叶作
物组成型高表达载体，并通过基因枪介导将其导入
小麦扬麦
12
号，进一步分析了
AtNPR1
基因在转基因
小麦后代中的表达以及对小麦纹枯病的抗性，以评
估转基因小麦中
AtNPR1
基因能否正常表达以及该
基因在基因工程培育抗纹枯病小麦中的应用潜力。
1
结果与分析
1.1
AtNPR1
基因的克隆和载体构建
根据
AtNPR1
基因
DNA
序列设计引物，采用
PCR
方法从拟南芥基因组扩增出
2 125 bp
的
DNA
片段，
连接到
pGEM-T
载体，经测序和
Blast
验证，扩增
片段确实含有
AtNPR1
基因，该基因全长
2 079 bp
，
包含
4
个外显子和
3
个内含子，内含子的大小分别为
79 bp (
位于
562
-
640)
、
108 bp (
位于
1 377
-
1 484)
和
110 bp (
位于
1 689
-
1 798)
。采用
Sma
Ⅰ和
Sac
Ⅰ双酶
切获得
AtNPR1
基因，替代
pACH25
载体
(Christensen
and Quail, 1996)
中的
gus
基因，即获得
Ubiquitin
启动
子驱动的
AtNPR1
基因表达载体
pAC-NPR1 (
图
1)
。
图
1
质粒
pAC-NPR1
构造
Figure 1 Construct of plasmid pAC-NPR1
1.2
小麦的遗传转化与分子检测
共转化
6 300
枚小麦幼胚，通过愈伤诱导、分
化以及
L-PPT
筛选，获得抗
L-PPT
再生植株
126
株，
对其
T
1
后代喷施
Basta
除草剂，发现
27
株的后代
出现抗感分离，初步定为阳性植株。对这
27
株进行
PCR
检测发现，
20
株含有
AtNPR1
基因
(
图
2)
，其余
7
株未能扩增出相应片段，可能转基因植株只插入了
bar
基因片段或
AtNPR1
基因的片段。
1.3
转基因阳性植株的表达分析
采用
Basta
除草剂喷涂和
PCR
检测相结合的方
法筛选
AtNPR1
基因纯合的转基因株系，并对这些转
基因株系的农艺性状同时进行鉴定筛选。从转基因后
代株系中选取与受体亲本扬麦
12
号农艺性相近的
14
个转基因株系分析
AtNPR1
基因的表达以及对小