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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1447
-
1457
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1447
-
1457
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1448
(
王满
, 2011;
方文娟等
, 2005)
。
Maurice
等将玉米
C
4
光合途径中磷酸烯醇式丙
酮酸羧化酶
(phosphoenlpyruvate carboxylase, PEPC)
的全基因
(
pepc
)
，采用农杆菌介导的方法，导入水
稻粳稻品种
Kitaake
，实现了基因的高表达，并且籽
粒产量表现提高了
10%~40% (Ku et al., 1999)
，从而
掀起了利用
C
4
光合特性改造
C
3
植物，以增强光合
效率和提高水稻产量的热潮
(
李霞和焦德茂
, 2005)
。
而伴随高表达玉米
C
4
型光合酶基因
pepc
水稻的稳
定选育，不少的研究结果表明：高表达玉米
C
4
pepc
水稻具有高光效、抗旱以及耐光氧化胁迫等特性
(
李
霞等
, 2005a; Bandyopadhyay et al., 2007;
张边江等
,
2008;
周宝元等
, 2011)
。但这里引发的问题是如何
导入一个
C
4
光合途径关键酶的基因则引起水稻多
种生理特性的改变？已有研究表明；该基因的高表
达也引起了第二信使分子如磷脂酸
(Li et al., 2011)
、
H
2
O
2
(
任承刚和李霞
, 2010;
李霞和任承钢
, 2012)
和
NO (
陈平波和李霞
, 2012)
的变化，暗示该基因的表
达可能诱发了体内信号传导途径的变化，但这些研
究均在整体植株水平上的。在细胞学水平乃至单细
胞水平的深入研究，则更有利于该材料高光效特性
分子机理的揭示，因此，该材料悬浮细胞的建立是
在细胞和分子水平上研究其机理的前提和基础。
本研究以高表达玉米
C
4
型
pepc
基因水稻
(PC)
和未转基因的野生型
Kitaake (WT)
为研究材料，从
种子活力、外源激素的添加、渗透调节物质的调节
以及培养温度等因素上，研究供试水稻悬浮细胞系
的方法，试图进一步优化供试水稻悬浮培养条件，从
而建立高效稳定的水稻成熟胚悬浮培养体系，该研
究将为高表达玉米
C
4
pepc
水稻的分子机理的深入
和遗传改良提供技术支撑。
1
结果分析
1.1
供试水稻种子发芽率影响其愈伤组织的诱导
两个供试材料
PC
和
WT
种子在
M8
基本培养基
上
7 d
的发芽率均高达
95%
，外施激素
6
-
BA
，它的
浓度从
0
、
0.5 mg/L
、
1 mg/L
以及
1.5 mg/L
增加，对
供试水稻发芽率影响不大
(
表
1)
。其中
WT
种子的发
芽率则高于
PC
的，并且可以观察到，接种培养
14 d
后，
WT
出愈率则始终高于
PC
的，而且适当加入低
浓度的
6
-
BA (0.5 mg/L)
，则可显著增加其出愈率，但
随
6
-
BA
浓度的增加，则其出愈率则下降。可见，较
强的水稻种子活力可能有利于水稻愈伤组织的早发。
已有研究表明，外源激素
ABA
添加对水稻等禾
谷类作物胚性愈伤组织的诱导，胚状体的发生以及
在继代培养中诱导出更多胚性愈伤组织等均起重
要作用
(
李霞等
, 2005b)
。从表
2
看，加入
ABA
后，对
2
个供试材料的发芽率没有影响，但是将
6
-
BA
和
ABA
联合施用，则可部分增加
2
个供试水稻
7 d
后
的出愈率，可见
ABA
单独添加对水稻的出愈作用
有限，但当它和
6
-
BA
联合添加，则均可显著提高水
稻的出愈率。
1.2
不同浓度
2,4
-
D
对供试水稻愈伤组织的诱导
表
3
表明了不同浓度
2,4
-
D
对供试水稻愈伤组
织诱导的作用。对
WT
而言，以
N6
为基本培养基，
再单独添加了不同浓度的
2,4
-
D
，培养
7 d
后，其
中添加
3 mg/L
或者
4 mg/L 2,4
-
D
才能诱导出供试
材料的愈伤组织，其出愈率分别只有
13%
和
10%
，
表明，在水稻成熟胚愈伤组织诱导的培养基中添加
较高浓度的
2,4
-
D
，对其愈伤组织诱导的尽早启动
有一定促进效果。而对本研究的供试材料而言，
3 mg/L
2,4
-
D
为适宜浓度，低于或高于这个浓度范围，则
无此效应；但随着诱导时间的延长，当接种
21 d
后，
在添加不同浓度
2,4
-
D
的
5
种培养基上，均诱导出
了愈伤组织，而且随
2,4
-
D
浓度的增加，出愈率有
增加的趋势，其中添加
5 mg/L 2,4
-
D
的培养基中水
稻成熟胚的出愈率最高，其中
WT
的为
40.40%
。但
与
WT
相比，
PC
的出愈率相对很低。表
4
也进一步
显示，
ABA
和
2,4
-
D
联合施用，也有利于
WT
愈伤
组织的较早启动和高频发生，而
PC
则在
3 mg/L
2,4
-
D
，
1 mg/L 6
-
BA
和
1 mg/L ABA
三种激素联合
施用的培养基上，略微提高其出愈率。可见，在水稻
成熟胚愈伤组织诱导中，不同的基因型对激素的反应
是不同的，在
2,4
-
D
脱分化的基础上，适当添加
ABA
或者
6
-
BA
和
ABA
联合使用，有利于提高水稻成熟
胚的愈伤组织的诱导率。
1.3
有机附加物对供试水稻诱导愈伤组织的影响
不少研究显示，附加有机成分能够提高愈伤组
织的出愈率
(
李霞等
, 2008;
胡燕梅等
, 2010)
。表
5
结果表明，
PC
在添加
2 mg/L 2,4
-
D
和
1 mg/LABA
的愈伤组织诱导培养基中，再继续添加
2.8 g/L
脯氨
酸和
0.3 g/L
水解酪蛋白，接种
21 d
后，出愈率高
达
84.30%
，显著提高了其出愈率，而加入
2.8 g/L
脯氨酸和
0.3 g/L
酸解酪蛋白的培养基中，其愈伤组
织的出愈率也为
60.20%
；差别不大，分别在加入
2.8 g/L
脯氨酸和
0.3 g/L
酸解酪蛋白以及
2.8g/L
脯