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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1408
-
1413
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1408
-
1413
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1411
图
5
不同盐胁迫时间下内参基因标准化最适数目确定
Figure 5 Determination of the optimal number of reference
genes for normalization in various salt stress durations
图
6
对照条件下内参基因标准化最适数目确定
Figure 6 Determination of the optimal number of reference
genes for normalization in control condition
18S
持家基因作为内参基因进行研究，有报道指出
18S
持家基因不适合用于内参基因，主要是
18S
持家
基因无法利用
oligo-dT
引物进行反转录
(Jian et al.,
2008)
。综上说明不同实验条件、不同材料、不同组
织器官中，持家基因表达并非稳定。
3
材料与方法
3.1
植物材料
以
107
杨一年生木质化的枝条为试材，选取生
长基本一致的枝条并剪成长约
20 cm
的穗段插入盛
有自来水的水培箱中，置于人工气候室内，光周期
16 h
，昼夜温度分别为
28
℃和
22
℃。待根长约
5 cm
后，选择生长基本一致的扦插苗置于含
0.6% NaCl
(102.7 mmol/L)
的
Hoagland
营养液中胁迫处理，处理
时间分别为
0,
3 h,
6 h, 9 h
及胁迫
9 h
后恢复至无
NaCl
的
Hoagland
营养液中
12 h
。置于无
NaCl
的
Hoa-
gland
营养液中培养的材料作为对照。分别在这些
时间点进行盐处理及相应对照的取材工作。用去离
子水将材料迅速洗净，液氮速冻后放入-
80
℃冰箱
保存备用。
3.2
总
RNA
抽提及
cDNA
合成
总
RNA
提取方法见已发表文章
(
周祥明等
,
2012)
。核酸浓度测定在紫外可见分光光度计
Nano-
Drop ND1000 (
美国
)
上进行。取
OD
260/280
在
1.8~2.1
之间及
OD
260/A230
大于
2.0
的
RNA
进行下一步分析。
cDNA
的合成步骤为：取
2 µg
总
RNA
，
1 µL 1 µg/µL
Oligo-dT(15)
引物
(
鼎国
)
，
1.25 µL 10 mmol/L dNTP
加
DEPC
处理水混合至总体积为
15 µL
；然后
70
℃变
性
10 min
迅速置于冰上冷却；再加入
5 µL 5
×
RT
缓
冲液，
20 U RNA
酶抑制剂
(Ribonuclease Inhibitor,
TaKaRa)
和
200 U
反转录酶
(M-MLV Reverse Transcr-
iptase, Promega)
的混合液，
42
℃温浴
1 h
合成第一链；
每份
cDNA
稀释到
100 µL
后于-
20
℃冰箱保存待用。
3.3
内参基因的选择及引物序列
本实验所使用的内参基因及序列参见
Brunner
(Brunner et al., 2004)
。
3.4
实时定量
PCR
反应条件
qPCR
反应在
LightCycler 1.5 (Roche Diagnostics)
荧光定量
PCR
上运行。反应体系为
20 µL
，其中
2
×
SYBROR Premix Ex
Taq
TM(TaKaRa) 10 µL
，引物
(10 µmol/L) 1.0 µL
，
cDNA
模板
1 µL
，补去离子水至
20 µL
。反应条件为：
94
℃预变性
30 s
，
94
℃变性
5 s
，
55
℃退火
30 s
，
72
℃延伸
1 min
，
40
个循环，延伸阶段
收集信号。从
60
℃到
95
℃，每个循环增加
0.5
℃，持
续
0.05 s
获得解链温度，收集融解曲线荧光信号。
3.5
数据处理和分析
实时荧光定量
PCR
反应结束后，利用
Excel
软件
初步处理所获得的数据，如平均值，再利用
geNorm
程序进行数据分析。首先在
Excel
的横栏和纵列中分
别输入不同持家基因名称和处理，然后输入相应的
Ct
平均值；然后选择每个基因在不同处理中表达量
最高
(
最小
Ct
值
)
的样品作为参照并将其表达量设为
1
，再利用Δ
Ct
法将其余样品中该基因的表达量转
换成相对于该样品的相对表达量
(
李钱峰等
, 2008;
Vandesompele et al., 2002)
。相对表达量的计算公式
为
Q=E
Δ
Ct
，其中
E
为基因扩增效率、Δ
Ct=
最小的