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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1032
-
1037
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1032
-
1037
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1036
3.3
AhfatB
全长
DNA
序列的克隆
提取花生叶片中的
DNA,
以此为模板，用引物
AhfatB
-1/
AhfatB
-2
进行
PCR
扩增。在
20 μL
反应体系
中加入：
10
倍
Tap
Buffer 2 μL
，
2.5×10
-3
mol/L dNTP
1.6 μL
，
TapDNA
聚合酶
0.2 μL
，引物
AhfatB
-1 (10
-5
mol/L) 0.5 μL
，
AhfatB
-2 (10
-5
mol/L) 0.5 μL
，
ddH
2
O
0.5 μL
。
PCR
反应条件：
95
℃预变性
1 min
；
95
℃变
性
1 min
，
62
℃退火
1 min
，
72
℃延伸
1 min
，
30
个循
环；
72
℃后延伸
10 min
。
3.4
乙酰
ACP
硫酯酶基因
cDNA
的克隆及同源分析
用
TRIzol
法提取花生幼果中的
RNA
，用
TransGen RNA PCR kit
试剂盒进行反转录，以合成
的第一链
cDNA
为模板，进行
RT-PCR
扩增。扩增体
系及
PCR
反应条件同
3.3
。
将花生中的
AhfatB
序列与蓖麻、拟南芥和向日
葵中的序列进行同源比较，分析他们的同源性。
3.5
乙酰
ACP
硫酯酶基因植物表达载体的构建
以反转录
cDNA
第一条链作为模板进行
PCR
扩
增。反应体系及
PCR
反应条件同
3.3
。
PCR
反应后，
用
1%
琼脂糖电泳分离目的片段，回收目的片段。将
回收的目的片段和克隆载体
pEASY-T1
连接，转化
大肠杆菌
DH5α
，
蓝白斑筛选阳性克隆，挑取白色
克隆做
PCR
鉴定，挑选正确的阳性克隆测序。
将测序结果与
GenBank
公布的序列进行序列比
对，选用测序结果正确的样本用试剂盒提取质粒
DNA
，以此为模板，进行
PCR
鉴定。将克隆载体
PBI121
和重组载体
pEASY- AhfatB
分别用限制性内
切酶
Bam
HI
、
Sac
I
双酶切，回收
PBI121
的大片段和
pEASY-AhfatB
的小片段进行连接
(
图
10)
，将重组质
粒转化大肠杆菌，用
50mg/L kan
筛选重组质粒，挑
取抗
Kan
的单菌落，进行菌落
PCR
鉴定。
作者贡献
李晓斐是本研究的实验设计和实验研究的执行人并完
成数据分析，论文初稿的写作；万勇善、刘风珍是项目的构
思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。
全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由山东省花生良种产业化工程项目、国家公益性
行业科研专项
(Nyhyzx07
-
14)
和国家
863
计划
(2006AA100106)
共同
资助。
图
10
表达载体
PBI121-
AhfatB
构建连接流程图
注
: lacZ: β-
半乳糖苷酶基因
Z; 35S:
花椰菜花叶病毒
35S
启
动子
; Nos term:
终止子
; pUC ori/fl ori:
质粒复制起始位置
;
GUS: β-
葡萄苷酸酶
;
AhfatB
:
花生乙酰
ACP
硫酯酶基因
Figure 10 Construction process of expression vector
PBI121-
AhfatB
Note: lacZ: β-galactosidase gene Z; 35S: Cauliflower mosaic
virus 35S promoter; Nos term: Terminator; pUC ori/fl ori:
Element for plasmid DNA replication; GUS: β-glucuronidase;
AhfatB
: acyl-ACP thioesterase gene
参考文献
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Developmental
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purification,and
futher
characterization of 12:0-ACP thioesterase from immature
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1996, Two novel thioesterases are key determinants of the
bimodal distribution of acyl chain length of
Cuphea
palustris
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(
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