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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1032
-
1037
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1032
-
1037
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1034
1.2
花生
AhfatB
基因
cDNA
克隆及同源分析
采用
TRIzol
法提取山花
7
号幼果的总
RNA
，以
反 转 录
cDNA
第 一 条 链 作 为 模 板 ， 用 引 物
AhfatB
-1/
AhfatB
-2
进行
PCR
扩增。扩增产物经
1%
的
琼脂糖凝胶电泳后，得到一条
1 700 bp
左右与预期
大小相符的特异性条带
(
图
4)
。回收目的片段与
pEASY-T1
载体连接，转化大肠杆菌，挑选两个阳
性克隆送上海生工科技有限公司测序，测序结果
(
图
5)
显示，克隆片段长
1 486 bp
，与
GenBank
中公布的
花生中的
AhfatB
基因序列同源性为
99.51%
，确定克
隆到的序列是试验需要的目的片段。
目的基因片段碱基序列与蓖麻、向日葵、澳大
利亚坚果、拟南芥进行同源性比较，同源性分别为
51.67%
、
63.26%
、
61.78%
、
65.43% (
图
6)
。可见
AhfatB
基因在不同作物中有较高的保守性，也说明
我们得到的目的基因片段较准确，可以用于表达载
体的构建。
图
4
花生
AhfatB
基因
RT-PCR
电泳结果
注
: M: DNA marker DL2000; 1: PCR
产物
Figure 4 Electrophoresis o f RT-PCR products of
AhfatB
of
Peanut (
Arachis hypogaea
L)
Note: M: DNA marker DL2000; 1: PCR product
1.3
AhfatB
植物表达载体的构建
RT-PCR
扩增获得的
AhfatB
cDNA
序列经
1%
的
琼脂糖凝胶电泳回收后，与克隆载体
pEASY-T1
连
接，命名为
pEASY-
AhfatB
，提取质粒
DNA
，进行检
测，将连接后的载体
pEASY-
AhfatB
用
Bam
HI
和
Sac
I
双酶切，酶切结果如图
7
所示。由图
7
可见，通过双
酶切分别得到一条长片段的的载体和一条与目的
片段大小相同的条带。用
Bam
HI
和
Sac
I
同样酶切载
体
PBI121
，回收
PBI121
的大片段和
pEASY-
AhfatB
的
小片段进行连接，重组子命名为
PBI121-
AhfatB
。将
重组子转化大肠杆菌，用
50 mg/L kan
筛选重组子，
挑取抗
Kan
的单菌落，进行菌落
PCR
鉴定。菌液
PCR
(
图
8)
和酶切鉴定电泳图谱
(
图
9)
中均出现约
1500 bp
左右的目的条带，说明克隆的
AhfatB
基因片段已经
连接到
PBI121
载体上替换了
GUS
基因，从而构建了
花生基因
AhfatB
表达载体。
图
5
花生中
AhfatB
基因测序后所得序列
Figure 5 Sequence of
AhfatB
of Peanut (
Arachis hypogaea
L)
after sequencing
图
6
五种不同作物中
AhfatB
cDNA
序列的同源性比较
Figure 6 Homology Analysis for cDNA sequence of
AhfatB
from five crops
2
讨论
随着工业生产以及人类对植物食用油持续性
增长的需求，人类对植物油脂的需求越来越多样
化，原来的植物油脂种类已不能满足现代人的生
活、生产需求。因此，开发植物油脂种类的多样化
已成为植物脂肪酸合成代谢工程研究的焦点问题。
酰基
ACP
硫酯酶是催化脂肪酸合成的关键酶之一，