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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1278
-
1286
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1278
-
1286
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1284
GTGGCAGT
-
3' (RACE)
；
MYB4
-
F: 5'
-
GCCACCC-
TCTTGTGAGGAAACG
-
3'
；
MYB4
-
R: 5'
-
AATAA-
CTTGTCACGCAGAAAAACTA
-
3'
3.2.2
Cl
MYB4
预测蛋白的生物信息学分析
利用
DNAMAN
分析
Cl
MYB4
基因的
cDNA
序
列，分析完全开放阅读框。利用
ClustalX
进行基于
氨基酸序列的多重序列比对，
BioEdit
软件分析与其
它物种
MYB
蛋白在氨基酸序列上的一致性和相似
性。
MEME
在线分析
Cl
MYB4
的
MYB
结构域保守
氨基酸特点。
SWISS-MODEL
在线构建
Cl
MYB4
的
三级空间结构
(Arnold et al., 2006)
，并与
Pt
MYB4
和
At
MYB46
蛋白的进空间结构分析比较。
MEGA
5.0
构建基于蛋白序列的基因进化树。
3.2.3
Cl
MYB4
蛋白原核表达载体的构建
根据原核表达载体
pET
-
30b (+)
的
MCS
位点及
翻译起始位点特征，设计带有限制性内切酶
Hind
Ⅲ，
BamH
Ⅰ酶切位点的引物，扩增
Cl
MYB4
的蛋
白编码序列，不包含内含子以保证与
His6
-
tag
的正
常衔接而获得
His
标签的重组蛋白。经双酶切连接
反应后转化大肠杆菌
JM109
，筛选阳性克隆子测序
鉴定重组质粒的正确性。
引物序列：
MYB4
-
YF: 5'
-
CGGGATCCATGA-
GCTCCACAGATCAACC
-
3'
；
MYB4
-
YR: 5'
-
CCC-
AAGCTTGGTGAAATACATTTGATCGA
-
3'
3.2.4
Cl
MYB4
重组蛋白的原核表达与优化
提取构建正确的
pET
-
30b-
Cl
MYB4
质粒，转化
原核表达宿主菌
Rosetta
。将鉴定后的表达菌株接种
于
LB
培养基
(
含有
100 ug/ml Km)
中，
37
℃振荡培
养、过夜活化。次日，按
1%
的比例转接于新鲜
LB
培养基
(
含有
100 ug/ml Km)
中，
37
℃、
250 rpm
振
荡培养至
OD600
约为
0.6 h
，加入终浓度分别为
0 mmol/L
、
0.01 mmol/L
、
0.1 mmol/L
和
1 mmol/L
的
IPTG
，
37
℃、
250 rpm
诱导
4 h
。
8 000 rpm
离心收
集
1 ml
菌液，弃上清，加入
40 u1 1
×
PBS
振荡悬
浮菌体，加入
10 u1
的
5
×
SDS
上样缓冲液，混匀
后
100
℃煮沸
10 min
，
12 000 rpm
离心
5 min
，取其
上清液进行
SDS-PAGE
电泳检测
(
李晓薇等
, 2011)
。
3.2.5
Cl
MYB4
重组蛋白的纯化
将检测阳性表达的表达菌株
Rosetta (pET
-
30b-
Cl
MYB4)
接种于
1.2 L
含有
100 ug/ml
卡那霉素的新
鲜
LB
培养基中，
37
℃、
250 rpm
振荡培养；至
OD600
约为
0.6 h
，加入一定量的
IPTG
至终浓度
0.1 mmol/L
，
37
℃、
250 rpm
诱导培养
4 h
。离心收
集诱导后菌体，用
100 ml 1
×
PBS
重悬，超声破碎，
分别收集上清与沉淀，用
0.5% Triton
和
1 mol/L
、
2 mol/L
、
4 mol/L
、
8 mol/L
尿素
(pH8.0)
洗涤包涵体
沉淀，
SDS-PAGE
电泳分别检测上清与沉淀中是否
包含
Cl
MYB4
重组蛋白。
重组蛋白的纯化过程：根据优化的条件大量表
达
Cl
MYB4
重组蛋白，然后根据以上电泳检测的结
果将最优的尿素洗涤液，过
Ni
柱进行
Cl
MYB4
重
组蛋白纯化。结合完毕后，分别用
5, 20, 50, 100, 250,
500 mmol/L
咪唑进行洗脱，收集洗脱液，进行
SDS-PAGE
电泳检测，详细步骤按
Ni-Agarose His
标签蛋白纯化试剂盒使用说明
(
康为世纪
)
。
作者贡献
吕运舟，郑佳是本研究的实验设计和实验研究的执行
人并完成数据分析，论文初稿的写作；陈金慧参与实验设计，
试验结果分析；施季森是项目的构思者及负责人，指导实验
设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意
最终的文本。
致谢
本研究是在国家自然基金重点项目
(30930077)
资助下
完成；原核表达载体
pET
-
30b (+)
由中国林科院生物所馈赠，
在此一并表示感谢。
参考文献
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SWISS-MODEL workspace: a web-based environment for
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Bedon F., Grima-Pettenati J., and Mackay J., 2007, Conifer
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gene expression in wood-forming tissues of white spruce
(
Picea glauca
), BMC plant biol., 7: 17 http://dx.doi.org/
10.1186/1471-2229-7-17 PMid:17397551 PMCid:1851958
Bomal C, Bedon F., Caron S., Mansfield S.D., Levasseur C.,
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MYB8
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59(14): 925
–
939 http://dx.doi.org/10.1093/jxb/ern234