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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1278
-
1286
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1278
-
1286
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1283
DNA
结构域在物种之间是高度保守的。
虽然
R2R3
-
MYB
在
N
端的
DNA
结合结构域
的氨基酸基序高度保守，但是与
MYB
基因的转录
激活作用相关的
C
端氨基酸基序的变异率很高，保
守性极低
(Stracke et al., 2001; Wilkins et al., 2009)
，
这些特点与
MYB
基因家族在真核生物发挥着重要
且广泛的调节作用相关
(Bedon et al., 2007)
。植物中
的
R2R3
-
MYB
参与了植物初生和次生代谢过程，
细胞形态建成，发育过程及各种应激反应
(Stracke et
al., 2001)
。所以，分析杉木
Cl
MYB4
蛋白与其它蛋
白的进化关系有助于我们了解其生物学功能。根据
编码蛋白全长序列的聚类分析，我们发现
Cl
MYB4
蛋白与其它参与植物次生壁加厚过程转录调控的
R2R3
-
MYB
蛋白聚为一个亚族。
2003
年，
Patzlaff
等首次发现火炬松
Pt
MYB4
的异源表达会导致木质
素在转基因烟草植株的异位沉积，证明
Pt
MYB4
基
因在火炬松木材发育过程发挥重要作用。拟南芥
At
MYB46
被证实是其次生壁加厚过程的重要调控
基因，不但木质素会在过量表达植株中发生异位沉
积，同时导致某些细胞发生不正常的次生壁加厚现
象
(Zhong et al., 2007)
。
At
MYB46
和
Pt
MYB4
在桉
树中的同源基因
Eg
MYB2
也具有相似的生物学功
能
(Goicoechea et al., 2005)
。本研究发现
Cl
MYB4
与
以上基因的系统发生关系最近，杉木中的
Cl
MYB4
是与他们一类的同源基因。因此笔者认为
Cl
MYB4
基因同样可能在杉木木材发育过程中发挥重要的
调控作用。
以往的研究还发现，一些次生壁合成基因和木
质素合成功能酶基因的顺式调控元件
AC
序列
(AC
Ⅰ：
ACCTACC)
是其转录调控的分子基础
(Hatton et
al., 1995; Lacombe et al., 2000; Zhong et al., 2010)
。
参与次生壁合成调控的
At
MYB46
，
Pt
MYB4
和
Eg
MYB2
蛋白，以及木质素合成调控转录因子
At
MYB58/
At
MYB63
，
Pt
MYB1
等蛋白均可以在体
外与
AC
序列结合。本实验在原核表达菌株
Rosetta
中系统优化表达了杉木
Cl
MYB4
蛋白，进一步根据
重组蛋白的
His
标签纯化获得了
Cl
MYB4
重组蛋
白。一方面，可以通过
EMSA (Electrophoretic Mobility
Shift Assay
，电泳迁移率实验
)
分析
Cl
MYB4
重组蛋
白是否可以通过与
AC
序列相互作用来调控杉木木
质素合成基因的转录；另一方面可以结合其它分子
生物学方法如染色质免疫共沉淀等方法
(O'Neill et
al., 2006)
研究
Cl
MYB4
基因如何调控木质素之外的
其它次生壁组分生物合成的分子机理。迄今为止，
木质素合成过程的功能酶遗传改良已在多种林木
品种中开展了研究
(
章霄云等
, 2006;
李桢等
,
2009)
，但是在转录调控水平上改良木质素和次生壁
合成过程的研究没有报道，本研究克隆的
Cl
MYB4
基因为杉木在转录调控水平遗传改良木材品质奠
定了理论基础。
3
材料与方法
3.1
材料
3.1.1
实验材料及
RNA
提取
由福建洋口林场引进的杉木
6421
无性系的嫁
接植株，于
2008
年春定植于南京林业大学苗圃。
实验剪取两年生枝条的茎段，液氮速冻用于
RNA
提取。
CTAB
法提取总
RNA
，具体方法参考
Chang
等
(1993)
，杉木发育木质部转录组数据库由本项目
组保存。
3.1.2
菌株及质粒
大肠杆菌菌株
(
E
.
coli
) JM109
由本实验室保
存；
Rosetta
购自康为世纪生物公司；克隆载体
pMD19
-
T
购自
TaKaRa
公司；质粒
pET
-
30b (+)
由
中国林科院生物所馈赠。
3.1.3
工具酶及试剂
限制性内切酶
Hind
Ⅲ，
BamH
Ⅰ、
Taq DNA
聚
合酶，高保真酶，
T4 DNA
连接酶、
100 bp
和
DL2000
DNA ladder Marker
购买于
TaKaRa
公司
; RACE
实
验使用
SMARTer
TM
RACE cDNA Amplication Kit
(Clontech
公司
)
；
DNA
纯化回收试剂盒和质粒
DNA
提取试剂盒购于爱思进生物技术有限公司
;
Ni-Agarose His
标签蛋白纯化试剂盒
(Cat. No.
CW0893,
康为世纪
)
；其它生化试剂均为国产分析纯。
3.2
方法
3.2.1
Cl
MYB4
全长
cDNA
的克隆
根据
At
MYB4
蛋白序列在杉木发育木质部转录
组数据库中
(
本项目组保存
)
做本地
Blast
分析，查找
相似性最高的
contigs
。根据得分最高的序列设计引
物，以杉木“
6421
”无性系两年生茎段总
RNA
反
转录得到的
cDNA
为模板做
RACE
反应，获取
5'
未知序列。经拼接后重新设计引物获得
Cl
MYB4
基
因的全长
cDNA
，克隆至载体
pMD19
-
T
，转化大肠
杆菌
JM109
感受态，挑选阳性克隆子测序鉴定。
引物序列：
MYB4
-
5R: 5'
-
GAACGAGCAGGC-