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分子植物育种(网络版), 2012 年, 第 10 卷, 第 1278- 1286 页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1278- 1286
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
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图 3 ClMYB4 蛋白的三维空间结构预测及与 AtMYB46 和
PtMYB46 蛋白构象比较
注: A, B, C: 分别代表 ClMYB4, AtMYB46 和 PtMYB4 蛋白
R2R3 结构域预测的空间结构; D: 是已知空间结构蛋白
(1H8CC)的 R1R2R3 结构域, 为同源建模的模板空间结构
Figure 3 Predicted three-D structure of ClMYB4 protein and
compared with AtMYB46 and PtMYB4 proteins
Note: A, B, C: Predicted three-D structures of R2R3-domain
in ClMYB4, AtMYB46 and PtMYB4 proteins; D: Three-D
structure of 1H8CC as the template
利用 MEGA 5.0 软件的 Neighbor-Joining 法，构
建了基于蛋白氨基酸序列的系统进化树，如图 4 。
所研究的蛋白序列一部分为裸子植物火炬松和白
云杉的 R2R3-MYB 基因，一部分为桉树和拟南芥
中与次生壁和木质素合成转录调控相关的 MYB 基
因。结果显示，ClMYB4 与白云杉 PgMYB4，火炬
松 PtMYB4，桉树 EgMYB2 和拟南芥 At MYB46 聚
为一个亚组，拟南芥 At MYB46 已被证实是维管发
育决定基因 SND1 (Secondary cell wall related NAC
Domain1)的直接下游靶基因(Zhong et al., 2007)，负
责次生壁合成过程的转录调控。其他裸子植物 MYB
基因中，PgMYB2 与 PtMYB2、Pt MYB3 与 Pt MYB7、
PtMYB1、Pt MYB8 和 PgMYB1 各自聚为一个小类，
说明 ClMYB4 与白云杉 PgMYB4 ，火炬松 PtMYB4
的亲缘关系最近。此外，拟南芥 At MYB58 和
AtMYB63 单独聚为一类，而桉树 EgMYB2 和火炬
松 PtMYB14 聚为一类。
图 4 基于氨基酸序列构建的 ClMYB4 系统发育树
注: 方框内为参与次生壁合成调控的 R2R3-MYB 基因蛋白
亚族
Figure 4 Phylogenetic tree based on amino acid sequences of
ClMYB4
Note: The box indicated the R2R3-MYB protein subgroup
related to secondary cell wall biosynthesis
1.3 杉木 MYB 基因的原核表达条件优化
将构建正确的原核表达载体质粒 pET-30b-
ClMYB4 转化大肠杆菌 Rosetta 菌株。挑选阳性克
隆子在 37℃条件下采用 IPTG 浓度 0.01 mmol/L，
0.1 mmol/L，1 mmol/L 诱导后，SDS-PAGE 电泳显
示目的蛋白 ClMYB4 均可以表达，但是 ClMYB4
蛋白(70 kD, 如图 5)的大小与预测蛋白分子量大小
(54 kD)不太一致。不同的 IPTG 对重组蛋白表达的
诱导影响不明显，0.1 mmol/L，1 mmol/L IPTG 诱导
的效果较好，因此，我们选择 0.1 mmol/L IPTG 作
为大量诱导重组蛋白表达的使用浓度。
1.4 杉木 MYB 基因原核表达蛋白的纯化
分析发现 ClMYB4 重组蛋白不是以可溶性蛋
白形式存在，而是主要存在于大肠杆菌的包涵体