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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1278
-
1286
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1278
-
1286
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1279
NAC (NAC domain gene)
和
WOX (WUS homeobox
gene) (Ohashi-Ito and Fukuda, 2010)
。模式植物拟南
芥中鉴定的转录因子
At
MYB46
被证明是次生细胞
壁化学组分纤维素、木质素和木酮糖生物合成的共有
调控基因
(Zhong et al., 2007)
，而
At
MYB58/
At
MYB63
是木质素合成通路的直接调控转录因子
(Zhou et al.,
2009)
。在林木的木材发育过程中也发现一些
MYB
类转录因子参与调控次生壁生物合成及木质素的
生物合成，如火炬松中的
Pt
MYB1
、
Pt
MYB4
和
Pt
MYB8 (Patzlaff et al., 2003a; 2003b; Bomal et al.,
2008)
，桉树中的
Eg
MYB2 (Goicoechea et al., 2005)
，
杨树中的
Ptr
MYB3
、
Ptr
MYB20 (McCarthy et al.,
2010)
和
Ptr
MYB28 (Zhong and Ye, 2009)
。它们可以
与木质素生物合成基因的顺势调控元件
AC
序列相
结合，正向调节木质素单体的生物合成过程。火炬
松
Pt
MYB1
、
Pt
MYB4
、
Pt
MYB8
和桉树
Eg
MYB2
基因都在植株次生壁发生加厚的发育木质部中表
达，这些基因的过量表达都可以激活转基因植株次
生壁生物合成过程，造成相关基因的异位表达和木
质素的沉积
(Patzlaff et al., 2003a; 2003b; Bomal et
al., 2008; Goicoechea et al., 2005)
。
杉木是我国南方最重要的造林树种，以生长迅
速、材质优良而著称，尤其是心材棕红色的木材尤
为珍贵。但是对杉木优质木材形成过程，如次生壁
加厚及木质素生物合成的分子机理研究未见报道。
编号为“
6421
”的杉木优树无性系，于
1964
年选
自福建省洋口国有林场的一片约
30
年生的人工林。
不同时期的遗传测定表明，杉木无性系“
6421
”不
同性状的一般配合力和特殊配合力，均具有突出的
表现。围绕着从分子水平上解析该无性系优良特性
的形成机理这一目标，在前期常规育种的基础上，
项目组用该无性系进行了转录组分析。本文首次报
道，在杉木发育木质部中克隆了一个
MYB
基因，
其序列及编码蛋白预测显示
Cl
MYB4
属于典型的
植物
R2R3
-
MYB
转录因子，推测其可能与杉木次
生壁加厚和木质素合成的调控过程相关。此外，本
文通过构建原核表达载体
pE
-
30b-
Cl
MYB4
，转化大
肠杆菌菌株
Rosetta
，
SDS-PAGE
电泳观察不同浓度
IPTG (
异丙基-
β
-
D
-硫代吡喃半乳糖苷
)
对重组蛋白
表达的诱导效果，利用
His-tag
亲和技术成功纯化
了
Cl
MYB4
重组蛋白。
Cl
MYB4
及其重组蛋白的成
功表达，为下一步研究杉木木材发育次生壁加厚过
程的转录调控机理奠定了基础。
1
结果与分析
1.1
Cl
MYB4
全长
cDNA
的获得
通过本地
Blast
分析，我们获得了一条
1 200 bp
左右的
contig
，与火炬松
Pt
MYB4
同源。分析发现
其
5'
序列不完整。经过
5'RACE PCR
扩增，我们获
得了一条约
600 bp
的特异条带
(
图
1A)
。克隆后分析
测序结果，得到与以上
contig
部分重叠的
400 bp
长
的
DNA
片段，并含有起始密码子
ATG
，表明该片
段为目的基因的
5'
端序列。以杉木发育木质部
cDNA
第一链为模板，采用特异引物
MYB4
-
F/
MYB4
-
R
扩增目的基因全长，回收特异条带
(
图
1B,
1 500 bp
左右
)
。测序结果表明，该
cDNA
全长
1 453 bp
，
编码
413
个氨基酸残基的多肽。在
NCBI
上
Blast
比对分析，与火炬松等植物
R2R3
-
MYB
基因有较
高的相似性，命名为
Cl
MYB4
。
图
1
Cl
MYB4
基因的
PCR
产物
注
: M: DNAmarker (100 bp); 1: Smarter RACE
扩增
Cl
MYB4
的
5'
端产物
; 2: RT-PCR
扩增的
Cl
MYB4
全长产物
Figure 1 PCR products of
Cl
MYB4
Note: M: DNA marker (100 bp); 1: 5'-RACE PCR products of
Cl
MYB4; 2: Full length products of
Cl
MYB4
1.2
Cl
MYB4
基因的生物信息学分析
Cl
MYB4
基因编码一条
392
个氨基酸残基的
多肽，理论分子量为
44.5 KDa
，等电点为
5.72
。
基于
BioEdit
软件的
Pairwise alignment (ClustalW
BLOSUM62)
功能分析表明，
Cl
MYB4
蛋白与
Pt
MYB4
蛋白序列的一致性为
40.5%
，相似性为
47.66%
。但在
MYB
蛋白的
DNA
结合结构域
(DNA
Binding Domain, DBD)
序列上，它们的一致性和相
似性均为
88.03%
，
Cl
MYB4
与被子植物拟南芥
MYB46
的序列相似性也高达
79.66%
。利用
ClustalX
比对分析
Cl
MYB4
与火炬松
Pt
MYB1
、
Pt
MYB4
，
白云杉
Pg
MYB1
、
Pg
MYB2
、
Pg
MYB4
和拟南芥
At
MYB46
、
At
MYB58
、
At
MYB63
蛋白发现，它们在
蛋白
N
端的
MYB-DBD
序列上高度保守，均具有典
型的【
W-(X19)-W(X19)-W
…
F/I-(X18)-W-(X19)-W
】