Page 26 - 2012no37

分子植物育种(网络版), 2012 年, 第 10 卷, 第 1265- 1277 页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1265- 1277
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1276
表 8 41 对 SSR 引物清单
Table 8 The list of 41 SSR primers
序号 引物 染色体位置 cM 距离 序号 引物 染色体位置 cM 距离
No. Primer Chr. No. cM distance No. Primer Chr. No. cM distance
1 Xtxp482 SBI01 25.2 22 Xtxp317 SBI06 90.5~90.9
2 gpsb089 SBI01 53.8 23 Xtxp274 SBI06 90.9
3 gap57 SBI01 108.9~109.7 24 Xcup02 SBI09 99.9
4 Xtxp80 SBI02 18~19.7 25 Xtxp17 SBI06 149.3
5 Xcup26 SBI02 166.8 26 Xtxp481 SBI07 31.8
6 Xcup69 SBI02 198.5 27 Xtxp159 SBI07 38.3
7 Xtxp494 SBI03 4.2 28 Xtxp99 SBI07 130.0~130.5
8 Xtxp439 SBI03 127.3 29 Xtxp168 SBI07 131.5~132.8
9 Xtxp421 SBI03 137.4 30 gpsb067 SBI08 66.8
10 Xtxp424 SBI03 147.8~149.9 31 Xtxp516 SBI08 86.8~88.5
11 Xtxp343 SBI04 71.4~75.8 32 Xtxp105 SBI08 97.7
12 Sb1-10 SBI04 87.6 33 Xtxp321 SBI08 104.2
13 Xtxp41 SBI04 106.2~108.0 34 Xtxp289 SBI09 23.5~38.5
14 Xtxp60 SBI04 120.7 35 Xtxp287 SBI09 80.5~85.5
15 Xtxp021 SBI04 153 36 Xtxp258 SBI09 80.5~85.5
16 Xtxp65 SBI05 14.4 37 Xtxp230 SBI09 85.5
17 Xtxp015 SBI05 58.2 38 Xtxp010 SBI09 108.4
18 Xtxp23 SBI05 75.9 39 Xtxp20 SBI10 53.2~54.2
19 SBKAFGK1 SBI05 89.3~95.7 40 Xcup43 SBI10 102.6
20 Xtxp123 SBI05 93.1 41 Xcup07 SBI10 115.2
21 Xtxp6 SBI03 31.6
注: cM 距离数据来源于 Mace (2009)
Note: The data of cM distance come from Mace (2009)
三博远志公司合成。
3.2 试验方法
3.2.1 DNA 提取
本实验采用 CTAB 法(余传涨等, 2010) 并进行
了适当的优化：1、称适量样品，液氮下迅速磨成
粉末；2、将粉末转入 2.0 ml Eppendorf 管中，加入
65℃预热的 CTAB 缓冲液 700 µl，并使其混匀；3、
65℃水浴加热 45 min ，不断地轻轻倒转摇动。水浴
后，取出离心管，冷却至室温；4、通风橱下加入
700 µL 的氯仿：异戊醇(24:1)，轻轻倒转摇动 5~10
min；5 、室温下 12 000 rpm 离心 10 min，用去头枪
尖将上清转至一新 2.0 mL Eppendorf 管中；6 、加入
10 µL RNA 酶溶液(10 mg/mL)，37℃下温浴 30 min ；
7、重复 4~5 步骤；8 、加入-20℃预冷的异丙醇或
无水乙醇于 2.0 mL Eppendorf 管中，轻轻混匀。
-20℃冰箱静置一段时间后，至 DNA 凝集，室温下
钩出 DNA；9、76%乙醇洗涤两次，洗涤完毕后，
将 DNA 晾干；10、加入适量的 1×TE (PH 8.0)溶解
于试管中，4℃下保存备用。取 2 μL DNA 溶液，用
0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测。
3.2.2 PCR 扩增体系及程序
扩增体系：采用 10 µL 反应体系，其中含 1×
PCR Buffer2+ (含 2 mmol/LMg2+)，100 µmol/L dNTP，
0.24 µmol/L SSR 引物，0.4 U Taq DNA 聚合酶，20 ng
DNA 模板，其余用双蒸水补足。
扩增程序：94 ℃ 10 min，1 个循环；94 ℃ 1 min，
55 ℃ 1 min，72℃ 1 min，共 36 个循环(根据引物特
点可作适当调整 )；72℃ 10 min，4℃保存。(赵泽双
等, 2012)。扩增反应在 Bio-Rad 公司 MyCyclerTM PCR
仪上进行。
3.2.3 电泳检测
SSR 扩增产物在 6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
上分离。70W 预电泳 45 min，70W 电泳 45 min。
银染：将凝胶板置于 10% 醋酸溶液固定 20 min ；双
蒸水漂洗 3 min；在 2 L 新配的染色液(3g AgNO3)
中染色 20~30 min；双蒸水快速漂洗 1 次，时间不
超过 10 s；2L 显影液(25 g NaOH+7 ml 甲醛溶液)
显影；10%醋酸溶液中定影 5 min；双蒸水漂洗 5 min
后置于室温下自然晾干。