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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1191
-
1198
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1191
-
1198
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1196
的
EDTA (pH 8.0), 1.4 mol/L
的
NaCl
和
2%
的
ß
-巯
基乙醇
)
充分混匀，放进
65
℃的水浴中保温
1 h
。随
后，用
12 000 rpm
的离心机分离
10 min
，将上清液
吸至另一离心管中，加入
1/2
体积的氯仿
/
异戊醇
(24:1)
，轻缓颠倒混匀，用
12 000 rpm
的离心机再
离心
5 min
，重新将上清液转至另一离心管，并以
满足抽提两管的量为准。然后，在抽提形成的每一
管中加入
1/10
体积的
7.5 mol/L
醋酸铵和等体积
的冰乙醇
(100%)
，混匀，放在-
20
℃的冰箱中处理
30 min
或室温下过夜。取出，用
12 000 rpm
的离心
机再离心
15 min
，获得沉淀的
DNA
，用
70%
乙醇
将该
DNA
清洗
2
次，风干沉淀。再加入
TE
缓冲液
(
含
10 ng/μL RNaseA)
将其溶解后，放入
37
℃的水
浴中热处理
30 min
，取出，以岛津
UV
-
120
-
02
型
紫外分光光度计测定其在
260 nm
和
280 nm
的吸光
光度值，以确定其浓度和纯度，并最终将其稀释为
10 ng/μg
的样品，在低温下留存备用。
3.3 PCR
分析方法
按表
1
设计的各成分浓度方案，在反应体系为
25 μL
的条件下，采用
T-Gradiant (Biometra,
德
国
)PCR
仪对
DNA
进行扩增。其扩增条件是
94
℃预
变性
3 min
，
44
个循环按照
94
℃变性
1 min
、
50
℃
复性
1 min
、
72
℃延伸
2 min
进行，最后
72
℃再延
伸
10 min
，放在
4
℃下的低温条件保存。扩增结束
后，采用
8 μL
的电泳样量、核酸染色、
2%
的琼脂
糖凝胶成电泳，随后在紫外透射仪下检测扩增出的
产物结果，照相保存并做记录。
表
1
用于优化
SSR
反应体系的影响因子
Table 1 The influencing factors used in optimizing SSR amplification system
影响因子
浓度
Factors
Concentration
A
B
C
D
E
Mg
2+
(mmol/L)
a
1.4, 1.8, 2.2, 2.6 1.8
1.8
1.8
1.8
dNTP (mmol/L)
a
0.2
0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35 0.25
0.25
0.25
引物
(μmol/L)
0.1
0.1
0.06, 0.1, 0.14, 0.18 0.14
0.14
Primer (μmol/L)
a, b
DNA (ng/μL)
a, c
20
20
20
10, 20, 30, 40 30
Taq
酶
(U)
1
1
1
1
0.5, 1, 1.5, 2
Taq DNApolymerase dosage (U)
a
注
: a:
母液浓度
:
引物为
10 μmol/L, 10×buffer (
含镁离子浓度
18 mmol/L), dNTP
浓度为
2.5 mmol/L,
模板
DNA
为
10 ng/μL;
b:
引物序列
:
断穗引物
Xgwm161 (
前引物序列
(5' to 3'), GATCGAGTGATGGCAGATGG;
后引物序列
(5' to 3'),
TGTGAATTACTTGGACGTGG;
退火温度
60
℃
);
抗病引物
Xgwm582 (
前引物序列
(5' to 3'), AAGCACTACGAAAATATGAC;
后引物序列
(5' to 3'), TCTTAAGGGGTGTTATCATA;
退火温度
50
℃
); c:
模板
DNA:
来自龙陵顶芒大河头小麦
(
保存编号
:
云
0005, XM0912); A:
这个反应体系下
Mg
2+
浓度的设了四个浓度梯度的实验
; B:
这个反应体系下
dNTP
浓度的设了六个浓度
梯度的实验
; C:
表示这个反应体系下引物浓度的设了四个浓度梯度的实验
; D:
表示这个反应体系下
DNA
浓度的设了四个浓
度梯度的实验
; E:
表示这个反应体系下
Taq
酶浓度的设了四个浓度梯度的实验
Note: a: Liquor concentration: primer 10 μmol/L, 10×buffer (Mg
2+
concentration 18 mmol/L), dNTP concentration 2.5 mmol/L
and template DNA concentration 10 ng/μL; b: Primer sequence: Left (5' to 3') of Xgwm161 brittle rachis primer is
GATCGAGTGATGGCAGATGG and Right (5' to 3') is TGTGAATTACTTGGACGTGG (Tm is 60
℃
); left of Xgwm582 of
resistance stripe rust primer is AAGCACTACGAAAATATGAC and Right is TCTTAAGGGGTGTTATCATA (Tm is 50
℃
);
c: Template DNA: Long Lin Ding Mang Da He Tou Wheat (Preservation No: Yun0005, XM0912); A:The experimant of four Mg
2+
concentration gradients in the SSR amplification system; B: The experimant of six dNTP concentration gradients in the SSR
amplification system; C: The experimant of four Primer concentration gradients in the SSR amplification system; D: The experimant
of four DNA concentration gradients in the SSR amplification system; E: The experimant of four Taq DNA polymerase dosage
concentration gradients in the SSR amplification system
作者贡献
周国雁是本研究的实验设计与数据分析者、论文初稿
的撰稿者，李文春参与了本研究的实验设计，是实验研究的
具体执行人；伍少云是项目研究的构思者及负责人，指导实
验方案的设计、数据分析与论文描写，负责本文的修改。全
体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
感谢云南省科技厅“云南省优质高产多抗麦类新品种
选育
(2010BB005)
”项目、云南省农作物资源生物技术创新
团队和云南省财政厅—云南省农业科学院专项对本项研究
提供了资金资助，也感谢中国农业科学院作物科学研究所李
秀全老师为本项研究提供了部分种质资源材料。