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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1179
-
1184
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1179
-
1184
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
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研究背景
由
Magnaporthe oryzae
侵染水稻引起的稻瘟病
是水稻生产上危害最为严重的病害
(Baker et al,
1997)
。稻瘟菌也是研究植物与真菌病原相互作用的
重要模式生物。近年来的研究表明，病原菌分泌到
细胞外的蛋白质在其与寄主的互作中发挥着关键
作用
(Stergiopoulos and de Wit, 2009)
。利用双向电泳
等蛋白质组学研究方法对于植物病原真菌菌丝体
及分泌蛋白质的研究为揭示其发育和致病机制提
供了大量的候选蛋白进行下一步研究
(Gonzalez-
Fernandez and Jorrin-Novo, 2012; Espino et al, 2010)
。
Talbot
等人的实验表明氮饥饿胁迫能够诱导稻瘟病
菌产生可形成病斑的致病性分泌蛋白
(Talbot et al,
1997)
。苏源等发现不同致病力菌株的稻瘟病菌在氮
饥饿胁迫下产生分泌蛋白的致病力也不同
(
周晓罡
等
, 2009)
。这些结果表明，了解氮饥饿胁迫对稻瘟
病菌分泌蛋白组的影响对于阐释其致病机制具有
重要意义。蛋白质组由
Marc Wilkins
于
1995
年首
次提出，是指在特定的时间和空间上，一个细胞或
一个组织基因组所表达的全部相应蛋白质
(Wasinger
et al., 1995)
。双向电泳和质谱技术是目前广泛使用
的蛋白质组学实验方法。本课题组已经初步建立了
稻瘟病菌分泌蛋白双向电泳的试验方法并对不同
致病力菌株的分泌蛋白质的电泳图谱进行了比较
(
蔡永占等
, 2010)
。本实验中首先利用液相等电聚焦
将稻瘟病菌的分泌蛋白质按等电点进行组分分离。
将这些组分在水稻感病品种
LTH
的叶片上进行致
病力大小的检测而获得主要致病蛋白质分布的等
电点范围，根据此范围选择相应等电点分离区间的
胶条分别对稻瘟病菌在全氮培养和氮饥饿诱导条
件下的分泌蛋白质进行双向电泳。通过对二维图谱
的分析比较而获得表达量差异点并进行质谱鉴定。
1
结果与分析
1.1
液相等电聚焦及致病力检测
通过电泳，
Rotofor
将稻瘟病菌分泌的总蛋白质
分离为酸性蛋白质
(pH
＜
7)
和碱性蛋白质
(pH
＞
7)
两
个类群共
20
个组分。各组分测得的
pH
梯度分布见
图
1
。结果表明
Rotofor
能够有效的将稻瘟菌分泌的
总蛋白按等电点分开成
20
个组分。活性测试中在
这两个类群的蛋白中均有致病作用的组分并且症
状不完全相同，酸性蛋白活性组分造成的病斑要大
于碱性蛋白。这初步说明稻瘟病菌分泌蛋白质的致
病性是多个蛋白质共同作用的结果，酸性蛋白质可
能是其中主要的致病成分。图
2
中展示了部分组分
接种的典型症状。其中，致病性较强的组分集中于
酸性蛋白
2
、
6
、
7
、
9
和
10
这五个组分
(pH4.2~pH 6.9)
。
1.2
双向电泳结果及差异分析
本实验分别获得菌株
Y98-16
在全氮培养与氮
饥饿诱导下的
2
-
DE
分泌蛋白考染图谱，且制备的
图
1 Y98
-
16
氮饥饿诱导下总蛋白经液相等电聚焦电泳分离
后各组分
pH
Figure 1 The pH gradient of each fraction separated from total
secreted proteins of Y98
-
16 through Rotofor
图
2 Y98
-
16
分泌总蛋白
Rotofor
液相等电聚焦电泳后部分组分接种丽江新团黑谷叶片后的症状
注
: CK
为对照
,
用水处理
Figure 2 The symptom on leaves of LTH punched inoculated by 20 fractions separated through Rotofor, extracted from secreted
protein of Y98
-
16
Note: CK shows the control of water