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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1012
-
1016
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1012
-
1016
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1015
2
讨论
由于没有细胞壁，原生质体为作物遗传改良和
植物学研究提供了极为便利的试验材料。目前，已
被广泛应用于种质资源保存
(
马锋旺和李嘉瑞
,
1998;
王子成和邓秀新
, 2002)
、原生质体融合
(
司家
钢等
, 2002;
惠志明等
, 2005;
张丽等
, 2008)
、突变
体筛选
(Nyman et al., 1993; Wallin et al., 1993)
及遗
传转化
(Jeon et al., 2007;
肖荣凤等
, 2009)
等基础理
论研究。而获得大量有活力的原生质体是原生质体
培养成功与否的前提之一，虽然已有很多植物原生
质体分离获得成功，但并不是在任何情况下均能获
得大量活力好、质量高的原生质体。原生质体分离
受到较多因素的影响，包括植物的类型、基因型、
外植体类型及生理状态和酶液类型及浓度等。至
今，在辣椒上已有利用子叶、下胚轴为起始材料分
离原生质体，并获得愈伤组织及再生植株的相关研
究报道
(Donato et al.,1989; Jeon et al., 2007;
何晓
明等
, 1997)
。本研究利用辣椒叶片为试材，在分离
原生质体前对其进行低温预处理，结合酶液组成、
离心转速和时间筛选，获得了最佳辣椒叶片原生质
体分离条件，并在此基础上得到了愈伤组织，其研
究结果为辣椒原生质体培养再生植株的获得奠定
了基础。
此外，原生质体培养是进行原生质体融合的前
提。原生质体融合不同于有性杂交，在融合过程中
不涉及性配子，在转移胞质基因，培育新的优良细
胞质雄性不育系中发挥着重要作用。至今，在很多
作物中已利用原生质体融合改良细胞质雄性不育
系的报道
(Yang et al., 1988; Xue et al., 1995;
蔡小东
,
2007)
。然而，由于辣椒原生质体培养一直没有取得
明显突破，使得还未有利用原生质体融合技术来培
育优良不育系的报道。本研究利用辣椒细胞质雄性
不育系作为原生质体分离的供体材料，探索出了可
以获得大量活力好、质量高辣椒原生质体的分离条
件，研究结果也为利用原生质体融合创制辣椒优良
胞质不育系奠定了一定的基础。
3
材料和方法
3.1
材料
供试材料为辣椒细胞质雄性不育系
21A
和相
应的保持系
21B
，由江苏省农业科学院蔬菜研究所
辣椒课题组提供，于
2011
年春种植在江苏省农业
科学院蔬菜实验基地，常规管理。
3.2
无菌苗体系的建立
利用保持系
21B
的花粉对不育系
21A
授粉，
50 d
后采收自然成熟果实。在超净工作台上，用
75%
酒精对果实表面进行消毒，将果实剖开取成熟种子
接种到
1/2 MS
固体培养基上，分别置于黑暗处及
光照下萌芽和生长。培养温度
(26±1)
℃；光照强度
2 000~2 500 Lx
，光照时间
16 h/d
。
3.3
原生质体的分离和纯化
取苗龄
40 d
的无菌苗叶片约
1 g
，用解剖刀将
其切成
1 mm
宽的细条，置于盛有
10 mL
酶解液的
50 mL
离心管中，
Parafilm
封口，在
27
℃黑暗条件
下放置回旋摇床上酶解
(16 g/min)
。
2% (w/v)
纤维素
酶，
1%
果胶酶和
1%
离析酶分别溶于
CPW9(
含
9%
甘露醇
)
溶液中配制成基本酶液，
Ph 5.8
，过滤灭菌，
4
℃保存。
CPW9
为
(CaCl
2
﹒
2H
2
O 10 mmol/L
，
KH
2
PO
4
0.2 mmol/L
，
KNO
3
1.0 mmol/L
，
MgSO
4
﹒
7H
2
O 1.0 mmol/L
，
CuSO
4
﹒
5H
2
O 0.1umol/L
，
KI
10 umol/L)
，添加
0.1%MES
，
0.2%PVP
。用时，根
据需要添加不同比例的酶母液配制成各种浓度的
工作液
(
表
1)
。
将酶解后的混合物用
300
目无菌尼龙网过滤，
将滤液在
50 mL
离心管中离心，去上清液，用
CPW9
溶液悬浮底部沉淀的原生质体，洗涤离心
2
次。再
用原生质体培养液悬浮离心
1
次，然后在显微镜下
检查其纯化情况，并稀释成密度约
10
5
个
/mL
原生
质体悬浮液备用。原生质体产量测定参照李浚明
(1992)
的方法，重复
3
次。
3.4
原生质体的培养及愈伤组织形成
将纯化好活性高的原生质体悬浮于添加含有
6-BA
的
KM
8
P
培养基上，在
(26±1)
℃黑暗条件下采
用液体浅层培养法进行培养。把
3 mL
悬浮于培养
基的原生质体滴加到直径
60mm
的培养皿中，
Parafilm
封口，在
28
℃黑暗条件下培养，
2
周后，
添加无甘露醇的含有
6-BA
的
KM
8
P
液体培养基于
培养皿中，以稀释再生细胞团的密度和降低甘露醇
浓度。
作者贡献
刁卫平是本研究的实验设计和实验研究的执行人；王述
彬是项目的构思者，指导实验设计，论文修改；刘金兵和潘
宝贵参与试验结果分析；戈伟提供试验材料。全体作者都阅
读并同意最终的文本。