Basic HTML Version
分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1104
-
1114
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1104
-
1114
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1106
1
已克隆的植物病原真菌无毒基因
1.1
叶霉病菌无毒基因
由番茄叶霉菌
(
Cladosporium fulvurn
)
侵染而引
起的番茄叶霉病是一种真菌性病害，该病害是番茄
生产的重要病害之一
(
叶青静等
, 2005)
。番茄叶霉菌
是一种无性繁殖的胞外真菌性病原菌
(Thomma et
al., 2005)
。迄今，通过反向遗传学
(reverse genetics)
途径已从番茄中成功分离、克隆了
4
个番茄叶霉菌
无毒基因，即
Avr2
、
Avr4
、
Avr4
E
和
Avr9
；这些无
毒基因都编码富半胱氨酸的小分子量的蛋白激发
子
(Takken et al., 2000) (
表
1)
；能特异性介导番茄中
与之互补的
Cf
抗性基因的抗性。此外，在番茄叶
霉菌繁殖过程中，还分泌
4
种细胞外蛋白
(ECP1
、
ECP2
、
ECP4
和
ECP5)
进入质外体空隙；这些蛋白
在番茄植株中激发特异的过敏反应
(De Kock et al.,
2005)
。另外，新的细胞外蛋白
ECP6
与
ECP7
也已
被鉴定
(Bolton et al., 2008)
。
Avr2
编码由
78
个氨基酸组成的前体蛋白，该
蛋白经真菌蛋白酶类与植物蛋白酶类加工后形成
包含
8
个半胱氨酸残基的成熟蛋白，它们能够诱导
携带抗性基因
Cf
-
2
的番茄品种产生过敏性坏死反
应
(HR
反应
) (Dixon et al., 1996; Luderer et al.,
2002b)
。
Takken
等
(2000)
基于大多数无毒蛋白在携
有相应抗病蛋白的寄主植物中产生
HR
的思路；采
用功能性克隆法分离了无毒基因
Avr2
。通过构建病
原菌的
cDNA
文库，将
cDNA
组装到
PVX (potato
virusX)
双元表达载体上，并将重组的
PVX
载体接
种到番茄中，
PVX
介导的无毒基因与含相应抗性基
因的植物互作，在接种部位产生
HR
反应，从而被诱
导出来；继而可以获得相应无毒基因的克隆。在侵染
期间，
Avr2
至少抑制
4
种与寄主植物防御相关的半胱
氨酸蛋白酶的表达
(Kruger et al., 2002; Rooney et al.,
2005; Shabab et al., 2008)
。在抗性蛋白
Cf
-
2
存在的条
件下，无毒蛋白
Avr2
行使无毒因子的功能，且番茄
叶霉菌抗性基因
Cf
-
2
介导的抗性受
Rcr3
基因的调
控。
Avr2
基因的点突变、删除或转座子插入都能促使
AVR2
蛋白无毒性功能的丧失
(Luderer et al., 2002b)
。
近期的研究表明；番茄叶霉菌菌株的
Avr2
等位基因
间存在过多的非同义替换，显示了强烈正向选择迹
象。这主要是由于该基因的编码区域被插入或删除了
部分碱基，形成了截短的
Avr2
蛋白，从而引起功能
的改变
(Stergiopoulos et al., 2007)
。
基因的分离、克隆可通过
2
种不同的克隆途径
来实现，即反向遗传学途径和正向遗传学
(forward
genetics)
途径
(Takahashi et al., 1994)
。在反向遗传学
研究中，基因所影响的表型并不清楚，但可以通过
遗传转化来研究该基因的功能以及所引起的表型
变异。无毒基因
Avr4
、
Avr4E
和
Avr9
都是利用反向
遗传学的方法克隆得到。
Avr4
编码
135
个氨基酸的蛋白前体，该蛋白前
体分泌在番茄的质外体空隙中。其
C
-和
N
-末端经
蛋白酶类加工后形成成熟的蛋白
(Joosten et al.,
1997)
；其中包含
8
个对
Avr4
蛋白的构象与毒性至
关重要的半胱氨酸残基。并且，
Avr4
蛋白二硫化物
结合区域的结构与无脊椎动物几丁质结合区域同
源
(van den Burg et al., 2003)
。
van den Burg
等
(2006)
将
Avr4
蛋白结合到几丁质上，结果发现在病原菌侵
染植物期间，
Avr4
蛋白能够保护叶霉菌的几丁质。
van Esse
等
(2007)
将叶霉菌暴露在几丁质酶中，或
沉默番茄叶霉菌的
Avr4
基因时，发现该真菌对几丁
质酶的抑制显著降低，这进一步地证实了
Avr4
基因
只有在病原菌侵染寄主期间才表达。并且，番茄叶
霉菌
Avr4
基因最自然的变异是该基因编码区发生
的单个点突变，从而引起半胱氨酸残基的替换，一
方面可以逃避抗性基因
Cf
-
4
的识别，另一方面却
保留了几丁质结合活性
(van den Burg et al., 2003)
。
Avr4E
编码富含半胱氨酸的
101
个氨基酸的蛋
白，该蛋白在叶霉菌侵染植物期间，分泌到质外体
中并触发
Cf
-
4E
介导的
HR
反应
(Westerink et al.,
2004)
。很多叶霉菌菌株已经被证明能够逃避
Cf
-
4E
介导的抗性，这些菌株的
Avr4E
基因的编码区都显
示
2
个一致的点突变，该突变的
Avr4E
基因形成稳
定的具有
2
个氨基酸置换的
Avr4E
蛋白，即
Phe
62
Leu
与
Met
73
Thr (AVR4E
LT
)
的变化。
Westerink
等
(2004)
研究表明，
Avr4E
蛋白第
62
位的单个氨基酸
的非同义替换能够调控
Avr4E
与其相应抗性基因的
识别。目前，
Avr4E
基因及其编码产物的特征还有
待进一步研究。
Avr9
编码
63
个氨基酸的前体蛋白，经蛋白酶
类加工后形成包含
6
个半胱氨酸的成熟蛋白
(Westerink et al., 2004)
。前人的研究表明，这些半胱
氨酸残基是维持
Avr9
的结构稳定及诱导植物细胞
的
HR
反应所必不可少的
(Stergiopoulos and de Wit,
2009)
。
Avr9
能够诱导带抗性基因
Cf
-
9
的番茄品种
产生抗性。
Marmeisse
等
(1993)
基于同源重组的策
略，将番茄叶霉菌的
Avr9
基因敲除，结果并不影响