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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1080
-
1086
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1080
-
1086
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1085
别为
0.1 mmol/L
、
0.15 mmol/L
、
0.2 mmol/L
、
0.25 mmol/L
和
0.3 mmol/L
；引物用量分别为
0.1 μmol/L
、
0.2 μmol/L
、
0.3 μmol/L
、
0.4 μmol/L
和
0.5 μmol/L
；
Tag
DNA
聚合
酶用量分别为
0.5 U
、
1.0 U
、
1.25 U
、
1.5 U
和
2.0 U
；
模板
DNA
用量分别为
20 ng
、
40 ng
、
60 ng
、
80 ng
和
100 ng
，从而进行单因子多水平试验。
3.5.2
正交试验设计
采用
L
16
(4
5
)
正交试验设计，按照表
3
的方案将
Mg
2+
浓度、
dNTP
浓度、引物浓度、
Taq
DNA
聚合
酶浓度以及
DNA
模板浓度进行正交组合。
根据表
3
配制
20 uL
总体积的
PCR
反应体系，
每管除表中的变化因素外还含有
2 ul 10
×
PCR
buffer
，其余用
ddH
2
O
补足
20 ul
，每处理设
2
次重
复。
PCR
反应结束后，产物在
2.0%
琼脂糖凝胶中
电泳，经
EB
染色后，凝胶成像系统进行拍照分析。
3.6
菊芋
SRAP-PCR
反应体系稳定性检测
利用优化的体系，以
me9/em1
为引物选取
10
种菊芋
DNA
模板分别进行扩增，并以“青芋
1
号”
菊芋
DNA
为模板随机选择
10
种
SRAP
引物，进行
菊芋
SRAP-PCR
反应体系的稳定性检测。
表
2 SRAP
所用引物序列
Table 2 Primers sequence used in SRAP analysis
正向引物
序列
反向引物
序列
Forward primers
Sequence
Reverse primers
Sequence
me1
5'
-
TGAGTCCAAACCGGATA
-
3'
em1
5'
-
GACTGCGTACGAATTAAT
-
3'
me2
5'
-
TGAGTCCAAACCGGAGC
-
3'
em2
5'
-
GACTGCGTACGAATTTGC
-
3'
me3
5'
-
TGAGTCCAAACCGGAAT
-
3'
em3
5'
-
GACTGCGTACGAATTGAC
-
3'
me4
5'
-
TGAGTCCAAACCGGACC
-
3'
em4
5'
-
GACTGCGTACGAATTTGA
-
3'
me5
5'
-
TGAGTCCAAACCGGAAG
-
3'
em5
5'
-
GACTGCGTACGAATTAAC
-
3'
me6
5'
-
TGAGTCCAAACCGGTAA
-
3'
em6
5'
-
GACTGCGTACGAATTGCA
-
3'
me7
5'
-
TGAGTCCAAACCGGTCC
-
3'
em7
5'
-
GACTGCGTACGAATTCAA
-
3'
me8
5'
-
TGAGTCCAAACCGGTGC
-
3'
em8
5'
-
GACTGCGTACGAATTCTG
-
3'
me9
5'
-
TAGGTCCAAACCGGTAG
-
3'
em9
5'
-
GACTGCGTACGAATTCGA
-
3'
me10
5'
-
TAGGTCCAAACCGGTGT
-
3'
em10
5'
-
GACTGCGTACGAATTCAG
-
3'
em11
5'
-
GACTGCGTACGAATTCCA
-
3'
表
3 SRAP-PCR
反应体系的正交试验设计
Table 3 Factors in L
16
(4
5
) orthogonal design and levels of SRAP-PCR amplification system
处理组合
因素
Factors
Treatment
Mg
2+
(mmol/L)
dNTPs (mmol/L)
引物
(μmol/L)
酶
(U/20 uL)
模
(ng)
Primer (μmol/L)
Tag
DNA polymerase (U/20 uL) Template (ng)
1
2.0
0.16
0.25
0.6
50
2
2.0
0.2
0.3
0.8
60
3
2.0
0.24
0.35
1.0
70
4
2.0
0.28
0.4
1.2
80
5
2.25
0.16
0.3
1.0
80
6
2.25
0.2
0.25
1.2
70
7
2.25
0.24
0.4
0.6
60
8
2.25
0.28
0.35
0.8
50
9
2.5
0.16
0.35
1.2
60
10
2.5
0.2
0.4
1.0
50
11
2.5
0.24
0.25
0.8
80
12
2.5
0.28
0.3
0.6
70
13
2.75
0.16
0.4
0.8
70
14
2.75
0.2
0.35
0.6
80
15
2.75
0.24
0.3
1.2
50
16
2.75
0.28
0.25
1.0
60