Basic HTML Version
王惠哲等
, 2011,
黄瓜抗黑斑病相关
AFLP
标记筛选及
SCAR
转化
,
分子植物育种
Vol.9 No.87 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0087)
1629
记成功转化为
1
对
SCAR
标记，
SCAR
引物扩增产物
原来的多态性仍然存在，但
ATGGG
五个碱基的差别
仍需借助
PAGE (
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
)
进行分
离，虽然不如琼脂糖凝胶电泳简单，但
PAGE
可同
时将抗病株、感病株和杂合株检测出来，利于大量
材料的抗性鉴定，大大降低了
AFLP
技术相关操作
的繁琐性。
本研究获得的分子标记，为黄瓜抗黑斑病育种
材料的筛选和抗病品种选育提供了一种新的方法，
可在早代对表现优良的基因型进行鉴定，而且稳定
可靠，不受环境因素及季节的限制，提高鉴定的准
确性；可以实现黄瓜材料黑斑病抗性的快速、准确
鉴定，加快抗病品种选育速度，大大提高育种效率。
结合白粉病、霜霉病、炭疽病、褐斑病和黑星病的
相关标记可以快速实现黄瓜苗期多抗材料的筛选
以及多抗基因的聚合，快速培育出市场前景良好的
优质、多抗的黄瓜新品种。兼抗多种病害黄瓜良种
的应用，可以降低农药用量，减轻环境污染，因此，
本项研究具有较大的实践与理论意义，并会带来可
观的社会、经济效益。
3
材料与方法
3.1
材料
供试材料为黄瓜高代自交系
L63 (
高感黑斑病
)
和
L9 (
高抗黑斑病
)
及其自交群体
(F
2
) 242
个单株。黄
瓜黑斑病菌
086
为田间自然发病叶分离、鉴定并保
存。在上海生工生物工程公司合成
AFLP
引物，
Taq
DNA
酶、
dNTP
等试剂购自大连宝生物公司。
于
2008~2011
年在天津科润黄瓜研究所内完成
试验。
3.2
方法
3.2.1
抗病性鉴定
将抗、感病亲本、及
F
1
、
F
2
、
BC
1
a
、
BC
1
b
六世
代群体播种于装有灭菌蛭石的育苗钵中，放置于光
照培养箱中，正常管理。采用第一真叶喷雾接种法
(
孢子浓度
1~2
×
l0
7
孢子
/mL)
进行黑斑病菌接种鉴
定。采用如下分级标准
(0
级
:
无病症
; 1
级
:
接种叶出
现少数病斑
; 2
级
:
叶柄有轻微症状
,
病斑占叶面积
的
1/3
以下
; 3
级
:
叶柄变色
,
病斑占叶面积的
1/3
-
1/2;
4
级
:
叶柄干枯
,
病斑占叶面积的
1/2
-
2/3; 5
级
:
叶柄
干枯并下垂
,
病斑占叶面积的
2/3
以上
)
3.2.2
抗病、感病组构建及
AFLP
分析
采用改良的
CTAB
法分别提取各单株基因组
DNA
，经紫外分光光度计检测合格后稀释至
50 ng/μL
。
根据
BSA
法的原理，在抗病、感病群体中选取症状
明显的高度抗病、感病单株各
5
株组成抗病组和感
病组。
AFLP
分析参照
Vos (Vos et al., 1995)
的方法。
PCR
产物经
5% PAGE (
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
)
分
离，然后银染检测。
3.2.3 AFLP
标记筛选、验证
先在抗病、感病亲本间进行引物筛选，利用在
双亲间表现多态性的引物对抗病组和感病组单株
进行扩增，在抗病组和感病组间表现多态性的引物
组合可初步入选。筛选到的标记与抗性基因的连锁
关系经组外其余
F
2
单株验证可进一步得到确认。用
筛选出的标记对生产上已知黑斑病抗性的品系分
别进行分析，计算扩增带型与黑斑病抗性的实际表
现型的符合度。
3.2.4
特异片段的回收、测序及
SCAR
转化
采用煮沸法回收特异片段，扩增产物送至北京
三博远志生物公司测序。
根据
DNA
序列特点，遵循引物设计的一般原则
进行特异性
SCAR
引物的设计
(
上海生工公司合成
)
，
SCAR
扩增体系、程序及检测参照王惠哲等
(
王惠哲
等
, 2008)
的方法。
作者贡献
王惠哲、李淑菊、杨瑞环和管炜是本研究的实验设计和
实验研究的执行人；王惠哲、李淑菊完成数据分析，论文初
稿的写作；杨瑞环和管炜参与实验设计，结果分析。李淑菊
是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文
写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由天津市自然科学基金课题
(09JCZDJC18900
和
11JCYBJC09000)
资助。
参考文献
Chandler, L.D., and Thomas, C.E., 1991, Effect of leaf miner
feeding activity on the incidence of Alternaria blight
lesions on muskmelon leaves, Plant Dis., 75: 938-940
Gu X.F., Zhang S.Q., and Zhang S.P., 2006, The AFLP Markers
Linked with the Bitter Fruit Gene (
Bt
) in Cucumber,