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高雅等
, 2011,
小麦微核心种质
Glu-B3
位点低分子量麦谷蛋白亚基等位基因的
PCR
检测
,
分子植物育种
Vol.9 No.84
(doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0084)
1612
新的未知的等位基因，可见
PCR
方法还可用于开发
新的亚基类型。
Glu-A3
位点各等位基因的特异性标
记已经开发出来，并得到了很好的运用。为了全面
研究中国小麦的整个
LMW-GS
的分布，为育种亲
本选育提供依据，开发
Glu-D3
位点的相应各等位
基因的特异性标记迫在眉睫。
3
材料与方法
3.1
实验材料
中国小麦微核心种质共
285
个品种，由中国农
科院作物所作物种质资源与生物技术重点实验室
提供。
3.2
实验方法
3.2.1
基因组
DNA
的提取
选取
1-2
粒
(
籽粒小的取
2
粒
)
种子，用单粒磨
粉机磨碎后放入
2.0 mL
离心管中，采用
SDS-Tris
饱和酚法提取小麦基因组总
DNA
，用紫外分光光度
计检测
DNA
浓度，
1.5%
琼脂糖电泳检测
DNA
质量，
-20
℃
下保存备用。
3.2.2 PCR
检测
PCR
反应体系总体积为
10uL
，其中含
1×PCR
Buffer
，
2.5 mmol/L MgCl
2
，
0.1 mmol/L dNTP
，上
下游引物各
20 µmol/L
，
0.1 U
的
Taq
聚合酶和
20 ng
DNA
模板。反应体系配好后，覆盖一层石腊油防止
挥发，在
Bio-Rad My Cycler 1.0 PCR
仪上进行扩增。
Glu-B3
位点各等位基因的特异引物序列及目标片
段长度详见表
2
。
PCR
反应程序为：
94
℃
预变性
5 min
；
94 35
℃
s
，
55-62 35
℃
s
，
72 1 min
℃
30 s
，共
35
个循环；
72
℃
延伸
8 min
；
4
℃
保存。
PCR
扩增产物用
1.2%
琼脂糖凝胶，经
120 V
电压电泳
0.5 h
分离，
EB
染
色，
Bio-Rad
凝胶成像系统成像保存。
表
2
小麦低分子量麦谷蛋白亚基
Glu-B3
位点各等位基因的特异引物
(Wang, 2009)
Table 2 Specific PCR markers for LMW-GS Glu-B3 alleles defined by protein mobility (Wang, 2009)
引物名称
Marker name
引物
(5'-3')
Primer set Sequence (5'-3')
等位亚基
Allele
片段长度
Fragment size
gluB3a
SB1F CACAAGCATCAAAACCAAGA
SB1R TGGCACACTAGTGGTGGTC
a
1,095
gluB3b
SB2F ATCAGGTGTAAAAGTGATAG
SB2R TGCTACATCGACATATCCA
b
1,570
gluB3c
SB3F CAAATGTTGCAGCAGAGA
SB3R CATATCCATCGACTAAACAAA
c
472
gluB3d
SB4F CACCATGAAGACCTTCCTCA
SB4R GTTGTTGCAGTAGAACTGGA
d
662
gluB3e
SB5F GACCTTCCTCATCTTCGCA
SB5R GCAAGACTTTGTGGCATT
e
669
gluB3fg
SB6F TATAGCTAGTGCAACCTACCAT
SB6R CAACTACTCTGCCACAACG
fg
812
gluB3g
SB7F CCAAGAAATACTAGTTAACACTAGTC
SB7R GTTGGGGTTGGGAAACA
g
853
gluB3h
SB8F CCACCACAACAAACATTAA
SB8R GTGGTGGTTCTATACAACGA
h
1,022
gluB3i
SB9F
同
SB6F
SB9R TGGTTGTTGCGGTATAATTT
i
621
gluB3bef
SB10F GCATCAACAACAAATAGTACTAGAA
SB10R GGCGGGTCACACATGACA
bef
750