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后猛等
, 2011,
甘薯
IbSPF1
基因植物表达载体的构建
,
分子植物育种
Vol.9 No.82 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0082)
1601
抗性基因的精确表达以及转基因细胞和植株中一
些有益药物蛋白成分的大量生产。与此同时，
SWPA2
启动子对于氧化胁迫过程中的信号转导研
究具有重大的意义。我们构建了含有不同启动子
(CaMV 35S
和
SWPA2)
的植物表达载体，目前正在
进行载体的遗传转化试验，并取得了一些较好的结
果，这些都为今后探索组成型启动子和胁迫诱导型
启动子在转基因植物抗逆效果上的差异提供研究
基础。
3
材料与方法
3.1
实验材料
3.1.1
植物材料
甘薯栽培品种高系
14 (
Ipomoea batatas
L. Lam.
cv. Kokei No.14)
由韩国生命工学院环境生命工学
研究中心植物抗氧化研究组繁育与保存，选取
15
d~20 d
的组培苗幼嫩茎叶为试材。
3.1.2
菌株及质粒
供试的感受态大肠杆菌
(
Escherichia coli
)
菌株
DH5α
、克隆载体
T-Blunt
均为韩国
SolGent
公司产
品；感受态根癌农杆菌
(
Agrobacterium tumefaciens
)
菌株
EHA105
、分别含有植物组成型启动子
CaMV
35S
和甘薯过氧化物诱导型启动子
SWPA2 (Kim et
al., 2003)
的植物表达载体
pCAMBIA2300(
抗性标记
为卡那霉素
)
由韩国生命工学院环境生命工学研究
中心植物抗氧化研究组构建与保存。
3.1.3
实验试剂
DNA
限制性内切酶、
Ex-
Taq
酶、
Pfu
高保真酶、
牛小肠碱性磷酸酶
(CIAP)
和
dNTP
购自
TaRaKa
；
T4 DNA
连接酶购自
Promega
；逆转录
(RT)
试剂盒
购自
Fermentas
；
DNA
凝胶产物回收试剂盒购自
Real Biotech
；
DNA
分子量
Marker
和高纯度质粒小
提中量试剂盒购自
SolGent
，其他试剂为
TaKaRa
产品。
3.2
实验方法
3.2.1
植物
RNA
的提取和纯化
采用
TRIzol
法
(Invitrogen
公司
)
提取甘薯总
RNA
，具体提取方法参考说明书进行。测定浓度后，
将其置于-
20
℃保存，以备后用。
3.2.2 PCR
扩增及其产物回收
首先，按照逆转录试剂盒的说明书要求，分别
以
GSP
和
Oligo (dT)
为引物将
RNA
转录为
cDNA
。
接着对
IbSPF1
基因进行
PCR
扩增，扩增条件为
94
℃预变性
2 min
；
94
℃变性
60 s
，
56
℃退火
45 s
，
72
℃延伸
90 s
，
25
个循环；于
72
℃延伸
10 min
，
PCR
产物用韩国
Real Biotech
公司
DNA
凝胶回收试
剂盒进行回收。
3.2.3
中间载体的构建及测序
将回收的目的
DNA
片段与
T-Blunt
载体连接，
转化大肠杆菌
DH5α
感受态细胞，在含卡那霉素的
培养基上蓝白斑筛选，用碱法小批量抽提质粒，并
作电泳鉴定和限制性内切酶分析。酶切鉴定片段大
小正确后，将扩增片段送韩国
SolGent
公司测序。
3.2.4
植物重组表达载体的构建及转化根癌农杆菌
将含有
IbSPF1
基因的
T-Blunt
载体用
Bam
HI
酶切，回收小片断后，克隆到经
Bam
HI
酶切的
pCAMBIA2300
载体
(
分别含有
CaMV 35S
和
SWPA2
启动子
)
上，构建成植物表达载体。冻融法
转化根癌农杆菌
EHA105 (An, 1987)
。
作者贡献
后猛、郑在哲和安哲汉是本研究的实验设计和实验研究
的执行人；后猛、郑在哲和郭尚洙完成数据分析，论文初稿
的写作；马代夫参与实验设计，试验结果分析；李强是项目
的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与
修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由中韩国际合作项目
“
应用生物技术防治沙漠化
的耐旱植物开发研究
”
、国家高技术研究发展计划
(863
计
划
)(2009AA10Z102)
、国家科技支撑计划
(2009BADA7B03)
和江苏省
“
六大人才高峰
”(2008201)
共同资助。作者感谢韩国
生命工学研究院环境生物工程研究中心植物抗氧化研究组
各位成员在本实验过程中的技术支持和有益建议。本文中提
到了我们实验中涉及的有关试剂供应商和测序服务商，这并
非我们为这些试剂供应商和测序服务商的产品和服务提供
推荐或背书。
参考文献
An G., 1987, Binary Ti vectors for plant transformation and
promoter analysis, Methods Enzymol, 153: 292-305
Ashida Y., Nishimoto M., Matsushima A., Watanabe J., and
Hirata T., 2002, Molecular cloning and mRNA expression