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张永辉等, 2011, 基于 ITS 和 cpDNA 序列的中国野生葡萄分子系统进化 , 分子植物育种 Vol.9 No.78 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0078)
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3.2 DNA 的提取扩增和测序
采用改良的CTAB 法从葡萄嫩叶中提取基因组
DNA(王姣, 2008)，在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳
检 测 ， 使 用 Bio-Photometer plus 核 酸 定 量 仪
(Eppendorf)检测基因组DNA的浓度和纯度，并将浓
度稀释至30~50ng/μL。
叶绿体和ITS序列信息( 表4)。
20 μL PCR扩增体系包括：30~50 ng DNA模板，
2 μL 10×PCR Buffer ，其它反应试剂及PCR反应程序
( 表 5)。利用胶回收及纯化试剂盒( 北京艾德莱生物
科技有限公司) 完成PCR产物的纯化。ITS序列的克
隆、测序选用pGEM-T载体(Promega) 和DH5α感受态
细胞 (天根生化科技有限公司) 完成。目标序列的连
接、转化，经菌落PCR验证，得到阳性克隆，每份
材料选择3 个克隆进行测序。
表4 cpDNA和ITS片段的引物信息
Table 4 The primer information of the cpDNA and ITS fragment
名称
Name
引物
Primer
序列
Sequenc
参考文献
Reference
AtpF 5′-ACT CGC ACA CAC TCC CTT TCC-3′ AtpF-atpH
AtpH 5′-GCT TTT ATG GAA GCT TTA ACA AT- 3′
Kim Ki-Joong, 2007;
Pennisi, 2007
PsbA 5′-GTT ATG CAT GAA CGT AAT GCT C- 3′ TrnH-psbA
TrnHGUG 5′-CGC GCA TGG TGG ATT CAC AAT CC- 3′
Shaw et al., 2005
A 5′-CAT TAC AAA TGC GAT GCT CT- 3′ TrnT-trnL
B 5′-TCT ACC GAT TTC GCC ATA TC- 3′
Taberlet et al., 1991
P1 5′-TCG CGA GAA GTC CAC TGA- 3′ ITS
P2 5′-ATG CTT AAA CTC AGC GGG -3′
Wang L., and Zhuo L.H.,
2006
表5 cpDNA和ITS片段的PCR扩增体系和反应程序
Table 5 PCR amplification system and cycling conditions used to amplify the cpDNA and ITS fragment
PCR 扩增体系
PCR amplification system
PCR 反应程序
PCR cycling conditions
引物名称
Primer name
Mg 2+
(mmol/L)
dNTPs
(mmol/L)
引物浓度(μmol/L)
Primer concentration
(μmol/L)
Taq DNA 聚合酶
Taq DNA
Polymerase
预变性
Predenature
35 个循环
35 cycles
延伸
Elongate
AtpF-atpH 1.5 0.2 0.4 0.5U 94ºC 5 min 94ºC 30 sec, 51ºC 40
sec, 72ºC 40 sec
72ºC
7 min
TrnH-psbA 1.5 0.2 0.4 0.5U 94ºC 5 min 94ºC 30 sec, 55ºC 40
sec, 72ºC 1.5 min
72ºC
7 min
TrnT-trnL 2.0 0.2 0.35 1U 94ºC 5 min 94ºC 30sec, 62ºC 1
min, 72ºC 1 min
72ºC
7 min
ITS 1.5 0.2 0.5 2U 94ºC 5 min 94ºC 30 sec, 52ºC 30
sec, 72ºC 1 min
72ºC
9 min
注: 在 trnT-trnL 和 ITS 的扩增体系中添加 BSA( 终浓度为 0.1g/L); 在 ITS 的扩增体系中添加 DMSO ( 为总反应体积的体系的
4%)
Note: Add BSA to trnT-trnL and ITS PCR reaction mix (final concentration was0.1g/L); Add DMSO to ITS-PCR reaction mix (4%
of total reaction volume)