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徐小万等
, 2011,
利用
cDNA-AFLP
技术分析不同耐性辣椒叶片表达差异
,
分子植物育种
Vol.9 No.66 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0066)
1489
达特性分析。
Bachem
等
(1998)
比较了
RAD-PCR
、
DD-PCR
及
cDNA-AFLP
技术对反应条件及模板质量的敏感性，
结果表明
cDNA-AFLP
要明显地优于前两者。目前
cDNA-AFLP
技术已经被广泛地应用于基因的表达
差异研究，并且被证实是比较有效的。杨寅桂等
(2007)
对黄瓜幼苗进行热激处理
2 h
，采用
cDNA-
AFLP
技术分离到了黄瓜热激响应基因。李浩等
(2007)
于小麦开花后
15~18 d (
灌浆中期
)
及
30~33 d
(
灌浆后期
)
分别进行连续
3 d
的高温胁迫处理，通过
cDNA-AFLP
分析获得差异条带，结果表明高温胁迫
对灌浆中期基因表达的影响比灌浆后期显著，实验
中
2
个品种在高温胁迫下的基因表达模式存在显著
差异。刘志勇等
(2008)
为鉴定番茄高温胁迫响应基
因，应用
cDNA-AFLP
技术，对高温胁迫早期叶片基
因表达进行了
mRNA
指纹分析。通过
768
对引物组合
的筛选
,
共分离得到
187
个差异表达的转录衍生片段
(TDFs)
，其中增强表达或高温胁迫下特异性表达
TDFs 153
条，抑制表达
34
条。
本研究用
66
对引物组合进行选择性扩增，共获
得
cDNA
扩增条带
3 200
多条，长度分别在
100~600
bp
之间。本研究表明，
cDNA-AFLP
技术适合于研究
辣椒热湿胁迫条件下基因的表达差异，选取扩增结
果差异较明显的
6
对引物组合，统计了基因表达异
同，共分离得到
315
条
TDFs
，其中
277
条
TDFS
与高
温高湿胁迫无关，
13
条
TDFs
高温高湿胁迫诱导表
达，
16
条
TDFs
高温高湿胁迫抑制表达，
4
条
TDFs
在
耐高温高湿材料中特异表达，
5
条
TDFs
在热湿敏感
材料中特异表达。本研究为进一步研究辣椒耐热湿
相关基因奠定了初步基础，但试验没有进一步对差
异条带进行测序分析，可以利用
RACE
或电子克隆
的方法获取其全长基因，进一步研究与辣椒耐热湿
性之间的关系。
3
材料与方法
3.1
植物材料与胁迫处理
本研究采用前期已鉴定的耐高温多湿品种
(
系
)
——Ⅰ品种
(
系
)
和热湿敏感品种
(
系
)
——
D
品种
(
系
)
(
徐小万等
, 2009a; 2009b)
，在
4~6
片叶期时，将其幼
苗移入华南农业大学测试中心人工气候室
(
光照强
度
20 000 LX)
进行如下处理：对照，
7:00~19:00
温度
维持
28
℃，
19:00~7:00
温度维持
18
℃，使昼夜温差
为
10
℃，
RH
为
75%
。高温高湿处理，
7:00~19:00
温
度维持
40
℃，
19:00~7:00
温度维持
30
℃，使昼夜温
差为
10
℃，空气相对湿度为
90%
，
4 d
后取第四片叶，
液氮速冻后，保存于-
80
℃备用。
3.2
总
RNA
提取及双链
cDNA
的合成
制备
RNA
的离心管、枪头等用
0.1%
的
DEPC
水
浸泡处理。叶片总
RNA
的提取采取
Trizol
法
(Invitrogen
公司
)
，按使用说明操作。
1.5%
普通琼脂
糖凝胶电泳检测
RNA
的完整性，同时用核酸蛋白仪
测定
RNA
的浓度。双链
cDNA
引用
SMARTTM PCR
CDNA Synthesis Kit
的方法合成。
3.3 cDNA-AFLP
差异片断分析
cDNA-AFLP
分析参考王永勤等
(2003)
的方法，
扩增产物在
6%
聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，银染检
测。上海生工生物技术服务有限公司合成
cDNA-AFLP
的引物和接头，
Ase
Ⅰ和
Taq
Ⅰ接头和引
物序列见表
2
。
作者贡献
徐小万、雷建军是本研究的实验设计和实验研究的执行
人；徐小万完成数据分析，论文初稿的写作。全体作者都阅
读并同意最终的文本。
致谢
本研究由现代农业产业技术体系建设专项基金及广
东省科技计划项目
(2009B060600004, 2010B020304001)
共
同资助。
参考文献
Altenbach S.B., and Kothari K.M., 2004, Transcript profiles of
genes expressed in endosperm tissue are altered by high
temperature during wheat grain development, J. Cereal
Sci., 40: 115-126
Bachem C.W., Van der Hoeven R.S., De Bruijn S.M.,
Vreugdenhil D., Zabeau M., and Visser R.G., 1996,
Visualization of differential gene expression using a novel
method of RNA fingerprint based on AFLP: analysis of
gene expression during potato tuber development, The
plant Journal, 9(5): 745-753
Bachem C.W.B., Oomen R.J.F.J., and Visser R.G.F., 1998,
Transcript imaging with cDNA-AFLP: a step-by-step
protocol, Plant Molecular Biology Reporter, 16(2):
157-173