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徐小万等
, 2011,
利用
cDNA-AFLP
技术分析不同耐性辣椒叶片表达差异
,
分子植物育种
Vol.9 No.66 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0066)
1487
为主，以高温胁迫或湿涝胁迫为研究对象的则很
少，对植物高温胁迫应答机制的研究也很有限，尚
未见到关于高温高湿双重逆境下辣椒转录谱动态
变化的研究报道
(Zhang et al., 2005; Rensink et al.,
2005)
。
cDNA-AFLP
是近年来发展起来的一种重要
的转录基因组学研究工具，具有高效、灵敏、重复
性强等特点，被广泛用于基因差异表达的研究
(Vandenabeele et al., 2003; Bove et al., 2005)
。因此，
本研究采用
cDNA-AFLP
技术研究高温多湿逆境下
辣椒叶片基因的差异表达情况，以期为获得有价值
的耐热湿相关基因奠定初步基础。
1
结果与分析
1.1 RNA
提取和检测
作为
cDNA
合成的原料，试验分别提取了对照
与处理的耐高温高湿湿品种
(
系
)
——Ⅰ品种
(
系
)
和
极不耐高温高湿品种
(
系
)
——
D
品种
(
系
)
第
4
片叶
中总
RNA
，每个样品约
0.1 g
。各样品
RNA
没有蛋
白质、酚类物质污染，总
RNA
OD
260
/
OD
280
值在
1.8~2.0
之间；
RNA
普通琼脂糖凝胶电泳
(
图
1)
，
RNA
没有发生降解，总
RNA
质量较好，适于
cDNA
合成，
28S
、
18S
和
5S rRNA
三条带清晰，
28S rRNA
和
18S
rRNA
条带整齐。
1.2 cDNA
合成
以图
1
提取的总
RNA
为材料合成
cDNA(
图
2)
，结
果表明
29
个循环为
cDNA
的第二链合成最佳的循环
数；合成的双链
cDNA
质量较好，
cDNA
在
0.1~3 kb
图
1
对照与处理Ⅰ、
D
品种
(
系
)
叶片总
RNA
电泳分析
注
: 1, 2, 3, 4
分别为Ⅰ品种
(
系
)
高温高湿处理
4 d
与正常条件
,
D
品种
(
系
)
高温高湿处理
4 d
与正常条件
Figure 1 Electrophoresis of total RNA in the
Ⅰ
, D line
Note: Lane 1, 2, 3, 4 are the total RNA of
Ⅰ
, D line, at 40
℃
/30
℃
(d/n), 90% RH and 28
℃
/18
℃
(d/n), 75% RH for 4 d
图
2
对照与处理Ⅰ、
D
品种
(
系
)
叶片总
RNA
反转录后
cDNA
电泳分析
注
: M
为
marker; 1, 2, 3, 4
分别为Ⅰ品种
(
系
)
高温高湿处理
4 d
与正常条件
, D
品种
(
系
)
高温高湿处理
4 d
与正常条件
Figure 2 Electrophoresis of cDNA reverse transcripted from
total RNA in the
Ⅰ
, D line
Note: M is the marker; Lane 1, 2, 3, 4 are the total RNA of
Ⅰ
,
D line, at 40
℃
/30
℃
(d/n), 90% RH and 28
℃
/18
℃
(d/n),
75% RH for 4 d
之间形成
Smear
。为保证合成产物浓度相当，个别
泳道长度稍短的样品加了
3~5
个循环。
1.3 cDNA-AFLP
结果分析
为分离与辣椒耐高温高湿有关的基因，对耐高
温高湿性较强的Ⅰ品种
(
系
)
和对热湿极敏感的
D
品
种
(
系
)
在高温高湿胁迫前后的基因表达情况进行了
分析，进行选择性扩增先后用
66
对引物组合，共获
得
cDNA
扩增条带
3 200
多条，长度分别在
100~600
bp
之间
(
图
3)
。选取扩增结果差异较明显的
6
对引物
组合，对基因表达的异同进行统计
(
表
1)
。
87.94%
的
条带在
4
个样品中均有表达，初步认为其可能代表
了辣椒中的
house-keeping
基因，在高温高湿胁迫前
后的表达量没有明显变化。在
4
个样品中有差异的
条带占
12.06%
，其中两个品种
(
系
)
高温高湿胁迫后
表达量均明显增强的条带占
4.13% (stress inducible
fragments at high temperature and high air humidity,
SIN)
，在两个品种
(
系
)
中高温高湿胁迫后表达量明
显减弱的条带占
5.08% (stress suppressible gene at
high temperature and high air humidity, SS)
，可能代
表辣椒共有的与高温高湿胁迫相关的基因，与遗传
背景无关。而在耐高温高湿品种
(
系
)
中受高温高湿
胁迫诱导特异表达基因
(expressed gene induced at
high temperature and high air humidity in resistant line,