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盛德鹏等
, 2011,
蛋白激发子
PeaT1
转化水稻恢复系多系一号的研究
,
分子植物育种
Vol.9 No.61 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0061)
1454
表
2
实验所用引物序列
Table 2 Primers used in this research
引物名称
引物序列
Primer Name Primer Sequence
F1
5'
-
TACTGCAGATGGCCAACCCCCGCATT
GAAGAG
-
3'
F2
5'
-
AGCCCGAGAAGAAGAACGTCCAGAT
-
3'
F3
5'
-
CGCTCAGAAGAACTCGTCA
-
3'
F4
5'
-
ATGGCCAACCCCCGCATTGAAGAG
-
3'
R1
5'
-
CGTCATGACTATATGCTCAGCGCCATG
ATGGA
-
3'
R2
5'
-
CTATATGCTCAGCGCCATGATGGAG
-
3'
R3
5'
-
TCTCCTGTCATCTCACCTTG
-
3'
R4
5'
-
CTATATGCTCAGCGCCATGATGGA
-
3'
带有
Pst
Ⅰ和
Xba
Ⅰ的酶切位点，以极细链格孢菌基
因组
DNA
为模板扩增
peaT1
基因，
PCR
扩增反应
条件为
94
℃预变性
5 min
，然后
94
℃
40 s
，
58
℃
35 s
，
72
℃
1 min
，
35
个循环，最后
72
℃延伸
10 min
。
PCR
产物纯化后连接到
pMD18
-
T
载体。
pMD18
-
T-peaT1
用
Pst
Ⅰ和
Xba
Ⅰ进行双酶切，将切下的片段连接到
经
Pst
Ⅰ和
Xba
Ⅰ双酶切的
pCMBIA2300
-
35S-OCS
载体。将构建好的
pCMBIA2300
-
35S-peaT1
-
Ocs
载
体用热激转化法转化到农杆菌
LBA4404
。
3.3
多系一号愈伤组织的诱导
将成熟的多系一号种子剥去颖壳，用
75%
的酒
精浸泡
1 min
，无菌水清洗两次；再用
2%
的次氯酸
钠处理
30 min
，无菌水冲洗至少
3
次，用无菌吸水纸
吸干多余的液体。无菌种子转移到添加
2.5 mg/L
2,4
-
D (2,4
-二氯苯氧乙酸
)
和
0.5 g/L
水解酪蛋白的
N6
、
MS
、
NB
培养基，组织培养过程采用
Toki
等的
方法
(Toki et a1., 2006)
，筛选适合诱导多系一号成熟
胚愈伤组织的培养基。
3.4
农杆菌介导的转化体系的建立
3.4.1
根癌农杆菌的制备
农杆菌接种于
2 mL YEB
液体培养基中，加入相
应种类和浓度的抗生素，本实验所用卡那霉素和利
福平的浓度均为
50 mg/L
，
28
℃、
180 r/min
培养过夜。
菌液
5 000 r/min
离心
3 min
，倒掉上清液，菌体重悬
后加入
N6
-
As
液体培养基中，
As (
乙酰丁香酮
)
的浓
度为
200 mg/L
。测定菌体浓度，
OD
600
在
0.4~0.6
之间。
3.4.2
农杆菌侵染愈伤组织
选取淡黄色、紧凑的愈伤组织放入无菌的
50
mL
离心管，将制备好的农杆菌菌液倒入离心管内，
完全浸过愈伤组织，轻轻摇动
10 min
。倒掉菌液，
用无菌吸水纸完全吸干愈伤组织表面残留的菌液，
然后将愈伤组织转移到
N6
-
As
共培培养基上，
22
℃
黑暗条件下共培养
48 h
。
3.4.3
筛选
共培养后的愈伤组织转移到无菌的
50 mL
离心
管中，用含有
500 mg/L
卡那霉素的无菌水冲洗三次，
每次轻轻摇动
3 min
，再用含有
600 mg/L
卡那霉素的
无菌水清洗一次，倒掉无菌水，用无菌吸水纸吸干
愈伤组织表面多余的液体。然后转移到含有
500
mg/L
卡那霉素和
0.5 g/L
水解酪蛋白的
N6
筛选培养
基，
25
℃光照培养
15 d
后更换一次培养基。
3.4.4
分化
筛选培养
30 d
后，将愈伤组织转移到含有
0.1
mg/L KT (
激动素
)
和
0.1 mg/L NAA (
-萘乙酸
)
的
N6
分化培养基，
28
℃光照培养
14 h
，
25
℃暗培养
10 h
。
30 d
左右分化出小苗后，转移到含有
1/2 MS
和
0.5
mg/L NAA
的固体培养基生根，根系发达后移栽到
温室培养。
3.5
转基因水稻的鉴定
3.5.1 PCR
和
RT-PCR
检测
基因组
DNA
提取采用北京全式金公司的植物
基因组
DNA
小提试剂盒，
RNA
提取采用
OMEGA
公
司的植物
RNA
小量提取试剂盒，从转化获得的
T
0
、
T
1
和
T
2
代水稻植株叶片中提取基因组
DNA
和总
RNA
。设计合成两对引物
2
和
3 (
表
2)
，通过
RT-PCR
验证
T-DNA
的整合，引物由
Invitrogen
公司合成。
PCR
反应条件为
94
℃预变性
5 min
，随之
94
℃
40 s
，
55
℃
40 s
，
72
℃
1 min 30 s
，
35
个循环，最后
72
℃
延伸
10 min
。
RT-PCR
按照北京全式金技术有限公司
两步法
RT-PCR
试剂盒说明书的方法。
3.5.2
转基因植株
Southern blot
检测
经
PCR
鉴定阳性的
T
2
代转基因植株每株取
4 g
叶片用
CTAB
法提取基因组
DNA
，用
Eco
R
Ⅴ酶切。
标记探针合成使用
PCR DIG Probe Synthesis Kit
(Roche)
，以含有
peaT1
基因的质粒为模板，引物为