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王帮太等
, 2011, SSR
标记简便快速鉴定玉米品种纯度
,
分子植物育种
Vol.9 No.60 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0060)
1449
PCR
扩增。
5 μL
的反应体系中含有
1 μL
实验提取的
DNA
、
0.05 µL Primer1 (40 μmol/L)
、
0.05 µL Primer2
(40 μmol/L)
、
2.5 µL 2
×
Taq mix
、
1.4 µL ddH
2
O
。
7.5 µL
和
2.5 µL
反应体系按比例增减。
PCR
扩增在
SensoQuest
LabCycler PCR
仪上进行。扩增程序为
95
℃预变性
3
min
，
1
个循环，
95
℃变性
40 s
，
59
℃退火
30 s
，
72
℃
延伸
40 s
，共
30
个循环，
72
℃延伸
8 min
，最后在
10
℃保存。反应结束后加入
2 µL 6
×
loading buffer
95
℃变性
5 min
，取出放人-
20
℃冰箱低温保存。
试验中使用的引物由上海生物工程有限公司
合成，
2
×
Taq
PCR MasterMix
购买于天根公司。
3.5
电泳检测
4.5%
的变性聚丙烯酞胺凝胶电泳。预电泳：功
率
100 W
，时间
5 min
；电泳：功率
75 W
，时间
30 min
；
加样量：
2.5 μL
。银染程序：
(1)
银染：放入染色液
(1 g AgNO
3
+1 000 mL
蒸馏水
)
中，轻轻摇动约
5 min
。
(2)
漂洗：将染色后的凝胶放入蒸馏水中，迅速漂洗
2
-
3 s
。
(3)
显影：把胶板放入显影液
(1 000 mL
蒸馏
水
+20 g NaOH+5 mL
甲醛
)
中摇动至
DNA
带显示。
(4)
洗涤：用自来水
(
注
:
本实验室自来水为地下水直接
供给
)
冲洗胶面上残留的
NaOH
后统计带型数据。
作者贡献
王帮太、秦贵文、郭华是本研究的实验设计和实验研究
的执行人；王帮太完成了数据分析、论文初稿的写作；张同
香完成实验样品的取样、初步分析；刘海霞参与完成实验分
析；张守林提供实验材料标准对照；郭华、常见智完成对文
稿英文、中文的校正工作；秦贵文是项目的负责人，指导实
验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同
意最终的文本。
致谢
本研究由河南省重大科技专项
(081100110400)
、国家农
业科技成果转化资金项目
(2010GB2D000270)
资助。作者感
谢河南农业大学付志远老师在本实验过程中的技术支持和
有益的建议。
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