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李跃飞等
, 2011,
大白菜桔红心基因
or
的
SSR
标记定位
,
分子植物育种
Vol.9 No.53(doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0053)
1395
个
RAPD
标记和由其转化而来的
SCAR
标记
(
刘秀
村等
, 2003;
王国臣等
, 2007; Zhang et al., 2008)
。
Matsumoto
等
(1998)
开展了大白菜桔红心基因方面
的研究，阐明了大白菜桔红心性状为一对隐性基因
控制的简单遗传并通过
RFLP
技术将此基因定位于
1
号连锁群上，距离最近的
RFLP
标记约
17 cM
。
Zhang
等
(2008)
找到了
3
个遗传距离分别为
10 cM
、
5 cM
和
10 cM
的
SCAR
标记，并通过
2
个锚定标
记将
or
基因初步定位于
9
号连锁群末端。前人报道
RAPD
、
SCAR
等显性标记由于无法区分纯合
(oror)
和杂合
(Oror)
基因型，在应用于实际的辅助选择育
种中时难免会受到一定程度的限制。开发共显性的
SSR
标记可以很好地克服上述缺陷，为育种者选择
目标基因型提供有力手段。并且由于
SSR
标记是基
于基因组序列设计的特异性引物，可以将与之相连
锁的基因锚定与染色体特定位置，这可以更加方便
我们在不同研究结果之间进行对比与整合。
本试验通过开发与大白菜桔红心
or
基因连锁
更为紧密的共显性
SSR
标记，进而相对精确地定位
此基因，利用
SSR
标记的优越性为以后该基因的精
细定位与克隆提供一定的理论依据，并为标记辅助
选择育种提供手段。
1
结果与分析
1.1
桔红心性状的遗传分析
在群体结球期，对双亲、
F
1
和
F
2
剖球调查性状。
经鉴定
Chiifu
心叶为白色，
07 A 163
心叶为桔红色，
120
株
F
1
代单株心叶均表现白心，试验组合
Chiifu×07 A 163
群体
F
2
共
600
株，经统计其中白心
446
株，桔红心
154
株，符合
3:1
的孟德尔遗传分
离规律
(χ
2
=0.142
＜
χ
2
0.05
=3.841)
，表明桔红心性状
为一对隐性基因控制的简单遗传
(
表
1)
。
表
1
大白菜桔红心性状在不同世代的分离情况
Table 1 Segregation in different generation of orange head inner leaf traits in Chinese cabbage
群体
Population
白心株数
No. of white leaf plants
桔红心株数
No. of orange leaf plants
总株数
Total number of plants
比率
Ratio
χ
2*
F
1
120
0
120
-
-
F
2
446
154
600
2.9:1
0.142
注
: *:
在显著性水平
0.05
、自由度为
1
情况下的卡方值
, χ
2
0.05
=3.841
Note: *: χ
2
in α=0.05 and n=1, χ
2
0.05
=3.841
1.2 SSR
标记分析
1.2.1
亲本间多态性的筛选
从合成的
500
对
SSR
引物中，挑选其中的
430
对可以较好覆盖大白菜
10
条连锁群的引物用于亲
本间多态性的筛选。这些引物均能在双亲间扩增出
稳定清晰的条带，经统计共扩增出约
630
条谱带，
其中有
228
对引物可以在双亲间揭示出差异。由于
所用
SSR
引物均为针对大白菜基因组设计的特异
性引物，所以在亲本间保持了较高的多态性比率。
1.2.2
基因池的分离体分组混合分析法
(BSA)
分析
在双亲间揭示出多态性的
SSR
引物，对基因池
进行
BSA
分析，通过筛选，共发现
6
对引物可以
在桔红心亲本
07 A 163
和桔红心基因池间扩增出清
晰的同等大小谱带，即认定可能与
or
基因存在连锁
关系。即使连锁距离较远的标记比较容易发生重
组，由于构建了多个混合池，组成某一池的所有单
株仍有可能都不发生交换，这样就可以尽量避免遗
漏掉较远的标记，利于早期确定目标基因位于哪条
连锁群上，加快试验进度。
1.2.3
单株验证及遗传距离估算
随即选取
20
株桔红心单株，利用初选的
6
对
引物对其进行验证，剔除不连锁的标记，发现
ENA
21
、
sau (N) 033
、与
or
基因表现出连锁关系，在
154
株携带纯合隐性基因
(
oror
)
的单株中对得到的标记
进行验证，它们发生交换的单株数分别为
64
株和
61
株，计算得到上述
2
个标记的交换率分别为
21.3
%
和
20.3 % (
表
2)
。