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王海莲等
, 2011,
高粱
SSR
技术体系的优化及分子连锁图谱的构建
,
分子植物育种
Vol.9 No.47 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0047)
1354
这种染色方法对
6%
和
8%
凝胶染色结果比较清晰，
而对于
10%
凝胶染色结果背景太重，分不清目的条
带。但是从染色时间上来说，用第一种染色方法，
整个银染过程大约需要
30 min,
而用第二种染色方
法，整个银染过程在
10 min
左右。
表
3
两种银染方法
Table 3 Two silver dyeing methods
方法
1
Method 1
方法
2
Method 2
1.
用含
10
％乙醇、
0.5
％乙酸的固定液固定
2
次，
6 min/
次
Place gels in fixing solution including 10% ethanol and 0.5%
acetic acid, and shake gently for 6 min, twice
1.
在含
10
％乙醇、
0.5
％乙酸的
0.2
％硝酸银中染色
5min
Place gels in solution including 10% ethanol, 0.5% acetic acid
and 0.2% silver nitrate , and shake gently for 5 min
2.0.2%AgNO
3
溶液渗透
10-12min
Replace the solution with 0.2% silver nitrate aqueous solution,
and shake gently for 10-12 min.
2.
蒸馏水中漂洗
30s
Rinse gels briefly with d H
2
O for 30 s
3.dH
2
O
清洗
2
次，
30s
Rinse gels briefly with d H
2
O for 30 s, twice
3.
在含
0.5
％甲醛的
3.0
％氢氧化钠中显色
Apply developing solution, including 3.0% Sodium hydroxide,
0.5% formaldehyde, and shake gently
4.0.002%
硫代硫酸钠溶液置大约
30s
，直到溶液变黄，倒掉
Apply 0.002% sodium thiosulfate aqueous solution, and shake
gently for 30 s. After the solution turned yellow, remove the
solution
4.
条带清晰后，用蒸馏水冲洗数次，终止显色反应
After the bands appear with desirable intensity, Wash gel in
distilled water several times to stop the reaction
5.
用含
NaOH 1.5%
，甲醛
0.4%
的显色液显色
Apply developing solution, including 1.5% Sodium hydroxide,
0.4% formaldehyde, and shake gently
6.
条带清晰后
,
用蒸馏水冲洗数次，终止显色反应
After the bands appear with desirable intensity, Wash gel in
distilled water several times to stop the reaction
1.4
优化体系的稳定性检测
通过分析比较
PCR
反应体系，聚丙烯酰胺凝胶
浓度和银染方法对实验结果的影响，
10 µL PCR
反
应体系，
6%
的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳和快
速银染法的组合方式基本能满足实验要求。为了验
证该组合的稳定性，对扩增片段大小分别为
150 bp
(Xcup50)
和
200 bp (Xcup02)
的两个引物在
F
2
群体的
48
个株系中的实验结果进行了分析。使用以上实验
方法，得到了较为清晰的条带
(
图
2)
。
1.5
高粱分子连锁图谱的构建
使用上述优化的
SSR
技术体系，对筛选出的
141
对多态性引物在
F
2
群体中的基因型进行鉴定。由于
有
13
对引物的条带较多，使用其他分析方法如改变
退火温度等后，带型仍较难区分而被剔除。最终对
128
对引物在
186
个
F
2
单株中的基因型进行了鉴定。
对
128
对多态性
SSR
引物进行卡平方测验，结果表
明：卡平方值大于
5.99
的偏分离标记共
30
个
,
偏分
离标记的比例为
23.4%
，其中有
19
个标记卡平方值
大于
9.21
，属严重偏分离标记。根据
128
对多态性
图
2 Xcup50
和
Xcup02
在
F
2
群体的
48
个株系中的稳定性检测
Figure 2 Stability testing of Xcup50 and Xcup02 in 48 lines of
F
2
population