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曾建斌等
, 2011,
烟草优质品种花全长
cDNA
文库的构建和质量鉴定
,
分子植物育种
Vol.9 No.40 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0040)
1305
表
2
引物名称及序列
Table 2 Primer name and sequence
引物名称
Primer name
引物序列
(5
'
to 3')
Primer sequence (5
'
to 3')
5
'
SMART IV Oligonucleotide
AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG
3' Primer
AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCGAGGCGGCCGA-d(T)30VN
5
'
Primer
AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT
M13 F
GTAAAACGACGGCCAG
M13 R
CAGGAAACAGCTATGAC
注
: V= A, G, or C ; N = A, G, C, or T
Notes: V= A, G, or C; N = A, G, C, or T
3.2
试验方法
3.2.1
总
RNA
提取
采用改良的
CTAB
法提取总
RNA
：取烟草花材
料，加液氮充分研磨呈粉末状，迅速转移到
5 mL
离心管中，加入
2.4 mL CTAB
提取缓冲液和
2% β
-
巯基乙醇，迅速振荡混匀，涡旋
3 min
，
65
℃水浴约
15 min~20 min
，吸取上清液经过两次等量氯仿／异
戊醇抽提，去除蛋白后，加入
LiCl
溶液沉淀两次，
用
75%
乙醇洗涤
2
次，干燥后分别用
RNase free H
2
O
和去离子甲酰胺溶解。得总
RNA
后，使用
ND
-
2000C
微量紫外分光光度计检测总
RNA
浓度、纯度，
1%
琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。
3.2.2
文库构建的主要步骤
主要参照美国
Clontech
公司开发的
SMART
文
库构建技术进行，根据实验需要，对部分步骤有所
改动。即以
3 μg
总
RNA
反转录得第一链
cDNA
，以
抑制
PCR
方法合成双链
cDNA
，双链经蛋白酶
K
消化
后进行
Sfi
I
酶切，将酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，
切割回收
750 bp
以上的区域，再与
pDNR-LIB
载体连
接，电转化大肠杆菌
DH5α
，获得原始文库。从中
随机挑取部分克隆进行菌落
PCR
和酶切鉴定以确定
文库的重组率及插入片段的大小。将原始文库菌液
涂板扩增后，得到的菌液按不同比例稀释涂板检测
扩增文库滴度。
3.2.3
文库初步测序及分析
随机挑取
24
个单菌落送上海国家人类基因组南
方研究中心进行测序，将测序结果去除载体和引物
序列后，利用
Blast2GO
软件进行分析，按照默认的
参数
(Blast program: BlastX, Blast database: nr)
先运
行
BlastX
，再进行
go-mapping
和
annotation
功能注释，
其中功能注释主要从分子功能、细胞组件、生物过
程三个不同的水平进行，并导出相应的归并数据。
作者贡献
曾建斌、陈华、陈顺辉是本研究的实验设计和实验研
究的执行人；曾建斌完成数据分析，论文初稿的写作；张冲
和蔡铁城参与部分实验研究；庄伟建是项目的构思者及负责
人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者
都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究是在国烟科
(2006)371
、闽烟科
(2008)13
和福建
省作物分子与细胞生物学重点实验室项目
(2008J1033)
共同
资助下完成，在此表示感谢。
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