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孙传波等
, 2011,
农杆菌介法将耐盐基因
HAL1
转入玉米自交系
H99
的研究
,
分子植物育种
Vol.9 No.22 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0022)
1163
盐检测表明，转
HAL1
基因植株的耐盐性比野生型有
明显提高。这表明，通过
HAL1
基因改良生物的耐盐
性是有效的。本文研究愈伤组织状态、农杆菌浓度、
侵染时间及真空压力等因素对玉米农杆菌遗传转
化的影响，建立适宜自交系
H99
的农杆菌转化体系，
通过体系将耐盐基因
HAL1
转入玉米自交系
H99
，获
得抗旱耐盐的优良玉米种质资源。
1
结果与分析
1.1
愈伤组织状态对遗传转化的影响
以继代不同时间的胚性愈伤组织为外植体进
行农杆菌转化，经
3
次筛选后，所得到的抗性愈伤
组织率不同。由表
1
的实验结果可以发现，胚性愈
伤组织状态明显的影响着抗性愈伤率，继代
5 d
后
转化的胚性愈伤组织其抗性愈率最高为
38.46%
，而
继代
0 d
和继代
12 d
的胚性愈伤组织转化后抗性愈
伤率分别为
5.61%
和
10.26%
，明显低于继代
5 d
的
胚性愈伤组织，由此可见选择继代
5 d
后的胚性愈
伤组织最适宜农杆菌转化。
表
1
继代天数对玉米遗传转化的影响
Table1 Effect of subculture days on maize transformation
继代天数
Subculture
days
侵染愈伤数
No. of
Infection
calli
抗性愈伤数
No. of
Resistant
calli
抗性愈伤率
(%)
Freqency of
resistant calli
(%)
0
2
3
5
6
10
12
107
106
115
104
150
121
117
6
9
37
40
42
22
12
5.61
8.49
32.17
38.46
28
18.18
10.26
1.2
农杆菌浓度
(OD
600
)
对遗传转化的影响
菌液浓度是影响遗传转化效率的关键因素之
一，以继代
5 d
的愈伤组织为外植体，用不同
OD
600
值的菌液转化胚性愈伤组织，经过
3
次抗性筛选后，
统计抗性愈伤组织率。由图
1
结果可以明显发现，
当
OD
600
=0.6
时抗性愈伤率最高为
35.33%
，
OD
600
=0.2
时最低位
8.33%
，当
OD
600
小于
0.6
时随
着菌液浓度增大，抗性愈伤率不断提高；当
OD
600
大于
0.6
时随着菌液浓度增大，抗性愈伤率反而降
低，这可能是由于高浓度菌体对愈伤组织的伤害大
图
1
农杆菌浓度对遗传转化的影响
Figure 1 Effect of bacterial concentration on maize transformation
和共培养后难抑制菌造成的。
1.3
真空压力和侵染时间对遗传转化的影响
在菌液
OD
600
=0.6
条件下，以继代
5 d
的胚性愈
伤组织为外植体，研究真空压力和侵染时间对转化
率的影响。由表
2
可以看出在
0.05 Mpa
和
0.07 Mpa
真空压力条件下，侵染
15 min
和
20 min
的抗性愈
伤率几乎相同，
20 min
比
15 min
的稍高，但是在实
验中我们发现，同等压力条件下，愈伤侵染
20 min
比
15 min
的难抑制菌，而且状态不好；相同侵染时
间时，
0.07 Mpa
比
0.05 Mpa
的愈伤难抑制菌，而且
状态不好；综合考虑选择
0.05 Mpa
真空压力，侵染
15 min
的转化条件。
1.4
转基因植株的分子生物学检测
通过该优化体系转化
1260
块
H99
胚性愈伤组
织，共获得转化植株
18
株，经过
PCR
初步鉴定，
其中
9
株呈阳性，抗性植株阳性率为
50%
，图
2
结
果显示，转基因植株扩增出
375 bp
的目的条带，和
阳性对照一致，可以初步证明外源基因已经整合到
玉米基因组中。
2
讨论
为了建立完善的农杆菌介导的玉米遗传转化
体系，本实验以
H99
胚性愈伤组织为外植体，研究
了胚性愈伤组织状态、农杆菌浓度、侵染时间和真
空压力等因素对转化效率的影响，并应用该体系将
耐盐基因
HAL1
转入自交系
H99
中。试验中发现，
胚性愈伤组织状态对转化效率影响非常明显，当以
继代
5 d
的胚性愈伤组织为外植体，抗性愈伤获得