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陈深广等
, 2011,
利用分子标记鉴定超级稻恢复系
R9308
的白叶枯病抗性基因
,
分子植物育种
Vol.9 No.15 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0015)
1109
IRBB5
相比，
R9308
也在
5
个小种上
(PXO71, 112, 340,
145, 280)
有抗性差异，这一结果说明，在
R9308
、
协
B
和
300
号中检测到的与
IRBB5
相同的帯可能仅
仅是
xa5
的等位基因，不具有抗性功能，或者说
R9308
中不存在
xa5
基因。虽然与单基因系
IRBB4
的
抗谱不尽相同，但
R9308
和
IR26
的抗谱最为接近，
此外两个杂种协
A/R9308
和协
B/R9308
与
R9308
一
致，而且也与
IRBB4
相似。结合分子标记检测结果，
说明恢复系
R9308
的主要白叶枯病抗源基因为
Xa4
。
另外，
R9308
与
IRBB4
最主要的抗性差异表现在小
种
9
上，
R9308
为抗，而
IRBB4
为感病，说明
R9308
可能存在未知的抗病基因。
2
讨论
我国具有丰富的稻种资源，发掘稻种资源中的
抗性基因甚至远源抗性基因是改良水稻抗性的重
要途径
(
章琦
, 2005;
沈玮玮等
, 2010)
。与其他病害
一样，培育抗白叶枯病的水稻新品种是防治该病害
的最有效途径。迄今为止，科学家已经在全球稻种
资源中鉴定了
32
个白叶枯病抗性基因。其中
Xa7
、
xa5
、
Xa21
和
Xa23
等基因具有广谱抗性，是白叶枯
病抗性改良的首选基因，可以通过标记辅助选择进
行聚合的方法加以利用。这一方法在白叶枯病抗性
改良种已经证明是行之有效的方法
(Huang et al.,
1997; Cao et al., 2003)
。
在杂交水稻选育中，通常利用的是显性白叶枯
病抗性基因，除非不育系和恢复系中都含有相同的
隐性基因。虽然已经鉴定了
30
余个白叶抗病基因，
但在生产实践中应用的往往是少数几个基因。在我
国，利用频率最高的是
Xa4
基因，抗源狭窄，潜藏
白叶枯病大爆发的危险。因此，有目的的利用多基
因抗性是解决这一问题的有效途径。为此，需要在
品种选育过程中对亲本材料的抗性基础具有充分
的了解。中国水稻研究所培育的杂交水稻恢复系
R9308
具有许多优异的农艺性状，分别来源于
C57
、
300
号和
IR26
。对国内白叶枯病小种的混合接种表
现中抗，但抗性基因以及其来源不清楚。本文采用
单小种鉴定方法，对杂交稻协优
9308
及其亲本协
B
和恢复系
R9308
，
R9308
的三个亲本
300
号、
C57
和
IR26
分别进行了鉴定。与预期的一致，
R9308
的抗
性基因来源于
IR26
的
Xa4
，但
R9308
的抗谱较
Xa4
为
广，因此可能还存在其他抗性基因，需要进一步研
究。从本研究结果看，
R9308
中不含
Xa7
、
xa13
和
Xa21
，也未检测到与
Xa23
、
Xa27
和
Xa32
(
t
)
的相关，
但包括这些基因在内，许多白叶枯病抗性基因还缺
少相应的单基因系。因此，需要加强这方面的研究，
为新基因的快速鉴定、等位性的研究等提供了基础。
3
材料与方法
3.1
水稻材料
R9308
为本课题组选育的籼型杂交稻恢复系，
亲本为
C57
、
300
号和
IR26
。
2009
年
R9308
与协青早
B
共同种植于中国水稻研究所海南繁育基地。以协
青早
A
和
B
为母本，
R9308
为父本分别配置组合。
2010
年两个
F
1
、协青早
B
、
R9308
及其
3
个亲本以及
白叶枯病抗性单基因系
IRBB3
、
IRBB4
、
IRBB5
、
IRBB7
，
IRBB8
、
IRBB10
、
IRBB11
、
IRBB13
、
IRBB14
和
IRBB21
作为单季稻种植于中国水稻所富阳实验
基地网室内。
3.2
白叶枯病小种与接种
采用
10
个菲律宾白叶枯病小种进行抗性鉴定，分
别为小种
1 (PXO61)
、小种
2 (PXO86)
、小种
3 (PXO79)
、
小种
4 (PXO71)
、小种
5 (PXO112)
、小种
6 (PXO99)
、
小种
7 (PXO145)
、小种
8 (PXO280)
、小种
9 (PXO339)
和小种
10 (PXO341)
。所有菌系于甘油中保存在
−80
℃
冰箱，接种前用
Wakimoto
培养基复壮菌株，置于
28
℃培养
48 h
，以无菌水配制接种菌液，浓度调至
1×10
9
CFU m/L
，在成株期采用剪叶法接种，每个
材料接种三片叶。接种后
15
天量取病斑长度和叶片
总长，以病斑长度占
20%
为抗感标准，小于
10%
为
抗病
(R)
，
10~20%
为中抗
(MR)
，
20~30%
为中感
(MS)
，
大于
30%
为感病
(S)
。
3.3
引物设计与
PCR
扩增
采用简易法提取水稻
DNA (
卢扬江和郑康乐
,
1992)
。利用文献报道合成了检测
5
个白叶枯病抗性
基因的
PCR
引物
(
表
2)
。
50 µL PCR
扩增体系中含：
5 µL
10
×
PCR
缓冲液
(Invitrogen)
，
10 µmol/L dNTP (
鼎
国
)
，
2 µL 50 mmol/L MgSO
4
，
1 µL 10 µmol/L
前引
物，
1 µL 10 µmol/L
后引物，
1
单位
Taq
DNA
聚合酶
(Invitrogen)
，
2 µL
模板
DNA
。反应条件：
94
℃预变
性
2
分钟；
94
℃
30
秒、
60
℃
30
秒、
72
℃
60
秒，共
35
个循环；最后
72
℃延伸
5
分钟。
PCR
产物在
1%
琼
脂糖凝胶上电泳检测。