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王月志等
, 2011,
砂梨
MYB
基因启动子克隆、生物信息学预测与等位变异分析
,
分子植物育种
(online) Vol.9 No.110 pp.1799-1806
(doi: 10.5376/mpb. cn.2011.09.0110)
1800
忠等
, 2003; Boerjan et al., 2003)
。已有研究揭示，木
质素的生物合成大致可分为
3
个步骤：首先是植物
光合作用后的同化产物到苯丙氨酸、酪氨酸和色氨
酸等芳香族氨基酸的合成过程；其后是从苯丙氨酸
到羟基肉桂酸
(HCA)
及其辅酶
A
酯类；最后是从羟
基肉桂酰辅酶
A
酯类到合成木质素单体及其聚合
物的过程
(
陈永忠等
, 2003; Boerjan et al., 2003)
。在
木质素合成的过程中有很多的酶参与作用，其中肉
桂酰辅酶
A
还原酶
(CCR)
和肉桂醇脱氢酶
(CAD)
催
化了第三阶段木质素单体的合成途径。
植物
MYB
转录因子家族成员众多，它们在结
构上的特点是具有保守的
DNA
结合结构域，已有
研究揭示它们主要在细胞周期和次生代谢中发挥
调控作用
(Stracke
et al., 2001)
。桉树
(
Eucalyptus
gunnii
)
中的研究发现，
MYB
转录因子
EgMYB2
与
EgCCR
和
EgCAD2
启动子的顺式调控区结合，正向
调控了
EgCCR
和
EgCAD2
在微管组织和木质化过
程木质部中的特异表达
(Lacombe et al., 2000;
Lauvergeat
et al., 2002; Goicoechea
et al., 2005)
。
EgMYB2
及其松树同源基因
PtMYB
4
过量表达的转
基因烟草与野生型相比，均表现出次生细胞壁明显
增厚，木质素含量显著增加；与木质素合成相关酶
类的表达丰度也明显提高
(Patzlaff et al., 2003;
Goicoechea et al., 2005)
。拟南芥
EgMYB2
同源基因
AtMYB61
的表达变异引起了突变体
det3
的木质化
异位
(Newman et al., 2004)
，
AtMYB46
、
AtMYB83
的
过量表达激活了纤维素、木聚糖和木质素的生物合
成路径，并引起非厚壁组织细胞次生细胞壁的异常
加厚
(Zhong et al., 2007; McCarthy et al., 2009)
。这些
研究结果表明，
EgMYB2
及其在不同物种中的同源
基因均有调控木质素合成功能。定位于遗传图普中
的
EgMYB2
还与控制桉树木质部木质素含量性状位
点表现出共分离，这表明，很可能是
EgMYB2
的等
位变异引起了不同基因型桉树材料间木质部木质
素含量的变化
(Goicoechea et al., 2005)
。
在梨果实发育过程中，果皮角质层和表皮细胞
破损后积累的木栓层形成果皮褐色锈斑
(
滕元文等
,
2005,
中国南方果树
, 34(3): 52-54, 56)
，木质素是木
栓层的重要成分
(Pereira, 1988; Lopes et al., 2001)
，
因此木质素的积累可能与梨果皮锈斑的形成有关。
此外，木质素是细胞壁次生结构和石细胞的主要成
分，石细胞是由细胞壁次生加厚、木质素沉积而形
成的，木质素的合成、转运和沉积与石细胞的发育
关系密切
(
乔勇进等
, 2005)
。因此在砂梨中开展木质
素合成调控的分子机理研究对分析砂梨相关品质
形成的机理具有非常重要的意义。
苹果和梨同为蔷薇科梨亚科，以前的研究揭
示，苹果和梨基因组间存在高度的微观共线性
(Yamamoto
et al., 2004; Velasco et al., 2010)
，苹果中
有关基因家族组成及序列信息可作为梨中同源基
因分析的重要参考。基因启动子在基因表达调控中
发挥着重要作用。本研究以苹果基因组序列信息为
桥梁，克隆了
4
个砂梨的
EgMYB2
同源基因启动子
序列，预测并分析了所获启动子的调控元件组成及
类型，以及各启动子在绿皮与褐皮果砂梨材料中的
等位变异情况。
1
结果与分析
1.1
苹果
EgMYB2
同源基因的搜索
以
EgMYB2
为探针序列，通过
BlastP
搜索苹
果蛋白数据库，共获得
4
条同源序列，分别为
MDP0000736994
、
MDP0000296109
、
MDP000072-
2954
和
MDP0000204495
，依次位于苹果的第
2
、第
7
、
第
3
和第
2
染色体，我们将其对应的基因分别命名为
MdMYBx1
、
MdMYBx2
、
MdMYBx3
和
MdMYBx4
。
序列分析发现，这
4
个基因与
EgMYB2
间分
别存在
76.1%
、
75.3%
、
69.9%
和
69.9%
的蛋白质序
列同源性；系统发生分析显示，
MdMYBx1
、
MdMYBx2
与
EgMYB2
聚为一组，而
MdMYBx3
和
MdMYBx4
与拟南芥的
AtMYB46
聚为一组，由此
可以推测，苹果基因组中的两组
EgMYB2
同源基因
(
图
1)
在苹果与桉树及拟南芥发生分化前已经存在，
在苹果与桉树及拟南芥发生分化后，这两组
EgMYB2
同源基因各发生了一次基因复制；苹果的
4
个
EgMYB2
同源基因与
AtMYB61
、
PtMYB4
间均
存在较大的序列分化。
1.2
砂梨
EgMYB2
同源基因启动子序列的克隆
我们分别选取苹果
MdMYBx1
、
MdMYBx2
、
MdMYBx3
和
MdMYBx4
起始密码子上游
1 000 bp
序
列进行分析，根据预测的启动子位置，在启动子上
游保守区段设计了
2
个正向引物
(MYBx1/x2:
5'CCAGTAGTACTTGGGGTTGTAGA3'; MYBx3/x4:
5'GATTGTGAAAGCTCCAAATCAC3')
，它们各自
与 位 于 启 动 子 下 游 保 守 性 反 向 引 物
(5'CATCTTCCTCTGGTGACCACAA3')
组合，分别
用于扩增砂梨品种初夏绿基因组中
MdMYBx1
/