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曾艳等
, 2011, 4
种水仙种质资源的
ISSR
和
AFLP
遗传多样性分析
,
分子植物育种
(online) Vol.9 No.105 pp.1759-1765 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0105)
1760
等，统称为中国水仙
(
Narcissus tazetta
L. var.
chinensis
Roem.)
。崇明水仙在崇明县已有
400
多年的栽培史，
具有花香幽雅、花期长等特点。早在二十世纪三十
年代已销往上海、江苏等地，是上海最具特色的传
统品牌之一。关于漳州水仙和崇明水仙分类一直存
在系同一种源的说法。相传古时，一艘满载水仙球
茎的漳州帆船在长江口翻沉，几年后，崇明人发现
江滩上长满了好看的花，就连根挖起移种到花圃。
经过几代人精心培育，育成了崇明水仙。洋水仙和
中国水仙同为石蒜科水仙属的植物，是水仙属的不
同物种，都是深受人们欢迎的花卉。正如她的名字
“洋水仙”，是漂洋过海从外国引进的品种，本文
提到的洋水仙主要是胡德山
(
Narcissus
‘Paricutin’
‘Mount Hood’)
，阳光光盘
(
Narcissus
‘Sun Disc’)
，帕
里库廷火山
(
Narcissus
‘Paricutin’)
和塔希提
(
Narcissus
‘Tahiti’)
。
目前，有关水仙的研究多集中于组织培养以及
染色研究等方向，崇明水仙与漳州水仙的分类系统
一直没有得到很好的定位，多数定位为中国水仙的
两大不同栽培类型，品种也较为混乱。于是，本实
验旨在通过
ISSR-PCR
标记
(
王建波
, 2002)
及
AFLP
分子标记指纹图谱分析
(
蒋细旺和张启翔
, 2006;
江
梅等
, 2006)
，为确立
4
种水仙种源资源的起源提供
分子依据。
1
结果与分析
1.1 ISSR-PCR
优化反应体系的建立
以崇明重瓣水仙
DNA
为模板，从
100
个引物
中扩增出
32
个有条带的引物。再利用崇明单瓣水
仙、漳州单瓣水仙、漳州重瓣水仙、状元水仙、洋
水仙对筛选出来的
32
个引物进行复选，最后得到
23
对扩增出清晰条带的引物
(
表
1)
。
综合单因素优化体系中各反应参数的浓度梯
度试验，确立的崇明水仙
ISSR-PCR
反应的适宜条
件为：
20 μL
反应体系中各参数的含量为模板
DNA
50 ng
，
Tag DNA
聚合酶
1 U
，引物浓度
0.5 μmol/L
，
dNTPs
浓度
0.25 mmol/L
，
10
×
PCR Buffer 3.5 μL
，
最佳退火温度为
56.8
℃。
通过单因素和正交设计对比发现，采用正交设
计优化的反应体系效果最好
(
图
1)
，反应体系更稳
定。该体系为：
20 μL
反应体系中各参数的含量为
模板
DNA 50 ng
，
TagDNA
聚合酶
1 U
，引物浓度
0.5 μmol/L
，
dNTPs
浓度
0.3 mmol/L
，
10
×
PCR
Buffer 2.5 μL
，最佳退火温度为
56.8
℃。
根据优化后的反应体系对每个水仙种群的
DNA
模板进行
ISSR-PCR
扩增，每个引物可扩增出
3~11
条
DNA
片段，平均
5
条。
23
个引物共扩增出
115
条带，其中
36
条具有多态性，多态性比率为
31.3% (
见表
1)
。
表
1 23
个引物编号
,
碱基序列和扩增结果
Table 1 Name of 23 primers, sequence and their amplication results
引物编号
碱基序列
记录位点数
多态性位点
引物编号
碱基序列
记录位点数
多态性位点
Primer No. Sequences Records a
points
polymorphic
loci
Primer
No.
Sequences
Records a
points
polymorphic
loci
811
(GA)
8
C
3
0
847
(CA)
8
AGC
5
2
814
(CT)
8
A
4
2
852
(TC)
8
AGA
6
3
815
(CT)
8
G
5
3
854
(TC)
8
AGG
3
0
824
(TC)
8
G
4
1
855
(AC)
8
CTT
4
1
825
(AC)
8
T
6
0
856
(AG)
8
CTA
6
0
834
(AG)
8
CTT
7
0
859
(TG)
8
AGC
4
2
835
(AG)
8
CTC
8
6
866
(CTC)
6
3
0
836
(AG)
8
CTA
7
2
880
GGA(GAG)
2
AGGAGA
11
7
841
(GA)
8
CTC
6
4
881
GGGTGGGGTGGGGTG
4
2
844
(CT)
8
AGC
4
0
890
ACGACTACG(GT)
7
3
0
845
(CT)
8
AGG
4
0
899
CATGGTGTTGGTCATTGTTCCA 5
1
846
(CA)
8
AGT
3
0
总计
115
36
平均
5.0
1.57
Total
Mean