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水生生物研究
, 2012
年
,
第
1
卷
,
第
7-13
页
Shuisheng Shengwu Yanjiu, 2012, Vol.1, 7-13
http://aor.5th.sophiapublisher.com
8
向敲除
myostatin
基因可明显抑制由糖皮质激素诱
发的肌肉萎缩
(Gonzalez-Cadavid et al., 1998)
。由近
来的研究可知，与
myostatin
基因编码区相比，
myostatin
基因的启动子区域序列不同物种间差异
较高，意味着
myostatin
基因的转录调控模式在不
同物种间可能存在着差异
(Gu et al., 2004; Du et al.,
2005; Yu et al., 2005)
。有少数研究对人、鼠和牛等
myostatin
基因启动子进行了探讨，发现一些转录
因子
(
如
MyoD, Smad, FoxO
和
MEF
-
2)
对
myostatin
基因的转录和表达起到调控作用
(Ma et al., 2001;
Spiller et al., 2002; Crisa et al., 2003; Salerno et al.,
2004; Forbes et al., 2006; Allen and Unterman, 2007)
，
然而，这方面仍有许多未知领域有待进一步研究。
目前已有较多鱼类的
myostatin
的研究，比如：
采用
RNAi
途径，给斑马鱼
(
Danio rerio
)
受精卵注射
myostatin
的
C
末端
dsRNA
，导致斑马鱼早期胚胎
的增生或肥大
(Acosta et al., 2005)
；斑点叉尾鲴
(
Ictalurus punctatus
)
经外源糖皮质激素处理
12 h
后，
myostatin
的表达下降
(Rodgers et al., 2003)
；虹鳟
(
Oncorhynchus mykiss
) myostatin
前体蛋白在生长激
素处理后升高
(Weber et al., 2005)
；转
GH (
生长激素
)
基因大麻哈鱼
(
Salmo salar
)
白肌组织也具有较高的
myostatin
前体水平等
(Biga et al., 2004)
。
Myostatin
作为一种肌肉生长的负性调控因子，通过对该基因
进行遗传改造，在渔业方面有着广阔的商业前景。
斑鳜俗称花桂或黑桂，隶属于鲈形目
(Perciformes)
、
鳜亚科
(Sinipercinae)
、鳜属
(
Siniperca
)
，是我国著名
的淡水经济鱼类，其肉质鲜美，口感细腻，富含不
饱和脂肪酸，有
“
淡水石斑
”
之称
(
符贵红等
, 2008)
。
与翘嘴鳜和大眼鳜等常见的鳜鱼养殖品种相比，斑
鳜虽生长周期较长，但其粗蛋白含量高，脂肪和灰
分较低，整体营养价值和肉质品质较高，且疾病少、
抗病能力强，具有较大的经济价值和应用前景
(
苏胜
齐等
, 2005)
。本研究通过对斑鳜
myostatin
启动子，
编码区和非编区的克隆及其结构特征的初步分析，
为进一步研究斑鳜肌肉生长和发育调控奠定基础。
1
结果与分析
1.1
斑鳜
myostatin
结构基因和启动子序列片段
PCR
扩增
以斑鳜白肌基因组
DNA
为模板，分别经三轮
Tail-PCR
和两组常规
PCR
反应来克隆
myostatin
的启
动子和
myostatin
的结构基因片段。
PCR
产物经的
1%
琼脂凝胶电泳检测，最终得到的一个约
1 kb
大小的
上游调控序列及两条分别约为
2 kb
和
1 kb
的结构基
因片段
(
图
1)
。
图
1
斑鳜
myostatin
基因和启动子
PCR
产物的琼脂糖凝胶电泳
注
: M: DNA MarkerIII (
天根公司
); 1
st
:
第一轮反应结果
; 2
nd
:
第二轮反应结果
; 3
rd
:
第三轮反应结果
; H1: F1
和
R1
为引物
的
PCR
反应结果
; H2: F2
和
R2
为引物的
PCR
反应结果
Figure 1 Agarose gel electrophoresis of the PCR product of
myostatin structural gene and promoter from Golden Mandarin
Fish
(
Siniperca scherzeri
)
Note: M: DNAMarkerIII (TIANGEN); 1
st
: The first amplification
product; 2
nd
: The second amplification product; 3
rd
: The third
amplification product; H1: The PCR product of F1 and R1; H2:
The PCR product of F2 and R2
1.2 PCR
产物测序
将
PCR
产物纯化回收，测序，然后将
3
个片段
的测序结果进行拼接，得到一个
3 228 bp
的片段，
其中上游调控序列长
868 bp
，结构基因长
2 360 bp
，
结构基因由
3
个外显子和
2
个内含子组成，外显子
大小依次为
379 bp
、
371 bp
和
381 bp
；内含子大小
分别为
395 bp
和
830 bp
。外显子总长为
1 131 bp
，
共编码
376
个氨基酸
(
图
2)
。氨基酸序列分析表明，
编码的氨基酸分子量大小为
42.55 kD
，等电点
pI
为
5.55
，氨基酸整体偏酸性。
1.3
启动子序列系统进化分析
从
Genebank
中查询得到大口黑鲈、斑马鱼、虹
鳟鱼、大黄鱼、花鲈、黄鳍棘鲷、鲤鱼、缨野鲮、
尖吻鲈、尼罗尖吻鲈、大鳞大麻哈鱼、金头鲷、比
氏骨鳊共
13
种鱼的
myostatin
的启动子序列，通过与
本实验克隆出来的斑鳜
myostatin
启动子进行比对。
然后利用
CLUSTALW
和
MEGA3.1
软件
N-J
法构件系
统发育树
(
图
3)
，
bootstrap
自举值取
1 000
次，显示不
同种属鱼类的进化及亲缘关系。
由图
3
表明：斑鳜、大口黑鲈、大黄鱼、花
鲈、黄鳍棘鲷、尖吻鲈、尼罗尖吻鲈、金头鲷、
比氏骨鳊这几种鲈形目鲈亚目鱼类在一个大的分
支上，斑鳜与大口黑鲈的亲缘性最近；属于鲤形
目鲤科的鲤鱼、缨野鲮、比氏骨鳊以及属于鲑形