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分子植物育种
(
网络版
), 2010
年
,
第
8
卷
,
第
9
篇
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2010, Vol.8, No.9
http://mpb.
5th
.sophia
p
ublisher.com
第
3
页，共
10
页
继代
3
个月，以激活
Tos17
的转座，愈伤组织诱导、
继代、分化的过程如图
2
所示。为了避免来自同一愈
伤组织分化出的植株含有相同的插入位点，愈伤组
织从诱导、继代到分化，每一颗愈伤都是独立培养，
每颗愈伤上分化出的植株只取一株。我们大约诱导
了超过
30 000
粒中花
11
号种子，产生出大约
22 000
颗愈伤，最后获得独立的水稻中花
11
号
Tos17
突变体
15 543
株。
图
2.
Tos17
突变体的创建过程
注：
A:
种子诱导
40
天
; B:
愈伤组织继代培养
; C:
愈伤组织
分化出芽
; D:
愈伤组织分化出苗
Figure 2 The process of generation
Tos17
insertioanl lines
Note: A: Calli were produced on mature seeds: B: Calli
subculture; C: Shoots were produced from calli; D: Seedling
generation
1.3
突变体库中
Tos17
插入位点数分析
为了评估插入突变体库中
Tos17
转座的位点数，
随机从突变体库中选取了
T
0
代再生植株
200
份，采用
Southern
杂交的方法检测再生植株中
Tos17
的拷贝数。
部分植株的
Southern
杂交结果如图
3
所示，箭头所示的
泳带为中花
11
号的原始拷贝，检测的再生植株中均含
有新的
Tos17
转座拷贝。统计检测的
200
份样品中总共
含有
Tos17
新拷贝
280
个，平均每个
T
0
代再生植株中含
有
1.4
个新的
Tos17
插入拷贝，据此推测本突变体库中
含有的新的
Tos17
拷贝数约为
21760
个。
1.4
侧翼序列的分离
接头
PCR(Adapter-PCR)
的一种非常有效的分离
侧翼序列的方法
(Piffanelli et al., 2007)
，通过设计合适
的限制性内切酶，连上特异接头，通过两步巢式
PCR
反应，可以获得
60%
以上植株的
Tos17
插入位点的侧
翼序列
(
图
4)
。由于我们所用的
Tos17
左右端特异引物
据左右边界都超过
200bp
，因此
Adapter-PCR
产物经
1%TBE
凝胶电泳后，回收片段大小在
200 bp
以上的
片段送往上海国家基因研究中心测序，小于
200 bp
的片段由于序列太短没有被回收。
图
3.
突变体库中
Tos17
插入拷贝数检测
注
:
箭头所示为水稻品种中花
11
号原始拷贝
; Line 1-5, To
代
再生植株
Figure 3 The examination of
Tos17
copy number in the
regeneration plants
Note: A: Arrows indicate the native copies in Zhonghua11;
Line 1-5 indicates the regeneration plants
图
4.
Tos17
侧翼基因组序列的扩增
注
:
两侧为
DNA Marker(5000bp, 3000bp, 2000bp, 1000bp,
750bp, 500bp, 250bp, 100bp)
；中间泳道为接头
PCR
电泳扩增结果
Figure 4 Amplification of the flanking sequence of
Tos17
in
regenerated plants
Note: The side lines indicate the Tran2K plus DNA Marker
(5000bp, 3000bp, 2000bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp,
100bp); The middle lines indicate the PCR amplified products
by Adapter-PCR method