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分子植物育种
(
网络版
), 2010
年
,
第
8
卷
,
第
9
篇
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2010, Vol.8, No.9
http://mpb.
5th
.sophia
p
ublisher.com
第
2
页，共
10
页
列已知，鉴定插入位点基因组序列容易，因此突变表
型和被突变的基因的之间的联系很容易建立，已成为
植物功能基因分离鉴定的重要策略之一
(Krishnan et
al., 2009)
。在近十年内，各国科学家在水稻中利用
T-DNA
或转座子已经创建了大量的突变体
(Martienssen 1998; Jeon et al., 2000; Wu et al., 2003;
Hirochika et al., 2004)
。虽然已经创建了大量的突变
体，然而只有
50%
的水稻基因被
“
标记
”
，因此还需要
利用各种不同的方法创建插入标签，使每一个基因都
能被
“
标记
”(Krishnan et al., 2009)
。
Tos17
是水稻中的一个内源的复制型反转录转
座子，全长
4 114 bp
，在栽培稻中含有
1-5
个拷贝
(Cheng et al., 2006)
，
Tos17
已被用于创建水稻转座子
插入突变体库。
Hirochika
等在
1996
年发现了
15
个水
稻中的反转录转座子，其中
Tos10
，
Tos17
，
Tos19
在
组培的条件下被激活。后经过大量研究后发现
Tos17
具有以下优点：
(1)
Tos17
在组培的条件下激活，分
化成植株后失活，因此
Tos17
插入引起的突变可以稳
定遗传；
(2)
Tos17
的拷贝数随着组培的时间而增多，
在
5
个月的组培时间下，可平均产生
10
个拷贝，可
以通过控制组织培养时间来控制转座的拷贝数；
(3)
Tos17
突变体的产生不涉及转基因过程，因此在一些
转基因控制严格的国家也可以使用。
(4)
Tos17
的转
座是随机的并能覆盖整个基因组
(Miyao et al., 2003;
Piffanelli et al., 2007)
。
Miyao
等
(2007)
构建了超过
50,000
个独立的再生植株，大约含有
500,000
个插入
位点并对突变产生的表型进行了分类。并且分离克
隆一些重要基因例如控制同源染色体配对的基因
Pair1
(Nonomura et al., 2004a)
和
Pair2
(Nonomura et
al., 2004b)
。
中花
11
号是一个典型的粳稻品种，由于其遗传
转化效率高、栽种地区适应性强，已成为我国水稻
功能基因组研究的模式品种之一。本实验室利用水
稻品种中花
11
号创建了超过
120 000
独立的
T-DNA
插入突变体
(Wu et al., 2003; http://rmd.ncpgr.cn/)
。农
杆菌介导的
T-DNA
转化经历了组培过程，研究发现
有
Tos17
在转化体中有新的转座
(Long et al.,
unpublished)
。然而，由于不同批次的转化植株组培
时间不一样，
Tos17
在有些批次的材料中没有转座或
转座的位点较少，难以采用高通量的方法批量鉴定
我室
T-DNA
库中
Tos17
的插入位点。同时为了丰富水
稻的突变体资源，实现水稻全基因组饱和突变体的
目标，本研究利用水稻中花
11
号为材料，创建了水
稻
Tos17
突变体库。本研究共创建独立的水稻
Tos17
突变体
15 543
株，分离非重复插入位点侧翼序列
524
条，并对
T
1
代
1,881
个家系进行了表型筛选。本研究
为丰富了水稻突变体资源、发掘分离水稻重要功能
基因奠定了基础。
1
结果与分析
1.1
组织培养时间决定
Tos17
转座的拷贝数
由于不同水稻品种中
Tos17
的拷贝数不一致，
且组织培养的时间导致
Tos17
新的插入拷贝不一
样。为了研究中花
11
号及不同组织培养期限后
Tos17
的拷贝数，我们采用
Southern
杂交的方法，
利用
Tos17
的特异探针检测了不同样本中
Tos17
的
拷贝数。如图
1
所示，野生型中花
11
号中含有
4
个拷贝，愈伤组织继代
1
个月后分化出的植株中能
检测到
Tos17
的新拷贝，说明
Tos17
的转座在组织
培养的初期就有可能发生转座。在愈伤组织继代培
养
2
个月的情况下，愈伤组织分化出的植株中几乎
都含有
1
个
Tos17
的新拷贝。在继代
3
个月的愈伤
分化出的每个植株中都可以检测到
Tos17
新拷贝，
新拷贝数为
1-3
个。随着愈伤组织培养时间的
延
长，
分化出的植株的中的新拷贝数增加。考虑到要保证
植株中都含有至少一个
Tos17
的新拷贝，而且较少
的拷贝数有利于对突变体与插入标签的共分离，本
研究确定
3
个月的愈伤组织继代的再生植株来大规
模构建的
Tos17
插入突变体库。
图
1:
愈伤组织不同继代时间再生植株中
Tos17
的拷贝数
注
: Line 1-10
：继代
3
个月
; Line11-20:
继代
2
个月
; Line
21-30:
继代
1
个月
; CK:
野生型中花
11
号对照
Figure 1 The copy number of
Tos17
in the regenerated rice
plant underwent different calli culture time
Note: Line 1-10, for 3 months; Line 11-20, for 2 months; Line
21-30, for 1 month; Ck, Varity Zhonghua 11 as a control
1.2
创建
Tos17
转座突变体库
将中花
11
号成熟种子放于
N
6
培养基上，经过大
约
45
天左右产生胚性愈伤组织，然后挑选结构紧
实、颜色鲜黄的胚性愈伤组织转移到继代培养基上