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分子植物育种 (网络版), 2010 年, 第 8 卷 , 第 7 篇
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2010, Vol.8, No.7
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导致内源 RNase 释放降解 RNA。此外由于植物材
料研磨不充分，造成多糖及蛋白质沉淀不完全，影
响总 RNA 的纯度(贾永红等, 2008; 赵锦等, 2009)。
实验通过对异硫氰酸胍法进行一些细节的改
良，在研磨后先加入变性液与巯基乙醇，通过进一
步研磨然后再进行分装，由于液氮的冰冻作用，可
以减少巯基乙醇的挥发。在液氮冻融过程中，变性
液与巯基乙醇可以更好的发挥对 RNase 活性的抑制
作用，继续研磨更有利于其与植物细胞的混匀，提
高 RNA 的提取效率。此外加大巯基乙醇的量，可
以在短时间内更好的抑制 RNA 酶的活性，减少其
对 RNA 的降解，从而得到了高质量的总 RNA。特
别是在大量提取总 RNA 时，改良的异硫氰酸胍法
更能突显它的优势，缩短实验时间，减少 RNase 污
染机会。利用该体系获得的高羊茅 RNA，不但纯度
高、完整性好，完全可以满足进一步分子生物学实
验的要求，为高羊茅分子标记辅助育种、基因定位
与克隆、高密度基因图谱的绘制和基因功能的研究
奠定了一定基础，同时也可为其他禾本科草坪草总
RNA 的提取提供借鉴和参考。
3 材料与方法
3.1 材料
以田间栽培的高羊茅为材料，采集幼嫩叶片，
经液氮处理后，迅速放置于-80℃ 超低温冰箱保存
备用。
3.2 无 RNase 环境的创建
RNA 提取必须创造无 NRase 的环境，所有离
心枪头都要用 0.1%~0.2% 的 DEPC 溶液处理，37 ℃
保温 12h 以上，然后高压灭菌，灭活 DEPC；研钵、
研棒、药匙、玻璃器皿等需在 160℃干烘 8 h 以上；
溶液都需用经 DEPC 处理过的水配制；电泳槽、胶
板及梳子等也用 DEPC 处理过夜或是用洗涤灵清洗
干净后用 0.5%的 SDS(Sodium dodecyl sulfate, 抑制
RNase 的活性) 浸泡过夜，然后用 ddH2O 冲洗干净
晾干备用(尹慧等, 2008; Malnoy et al., 2001)。
利用细叶桉(P2) DNA 进行 EST-SSR 引物的
PCR 条件优化，主要针对 PCR 体系的 Mg2+ 浓度和
PCR 程序的退火温度。PCR 优化后，选择 PCR 产
物长度不同的 32 个 EST-SSR 进行测序实验，引物
序列和 PCR 产物大小见表 1。 PCR 体系和 PCR 程
序参考张晓红等 (2009) ，退火温度均为 56℃ ，但
10Buffer 中 Mg2+ 浓度改为 15 或 20 mmol/L。
3.3 RNA 的提取
异硫氰酸胍法：参照 Chomczynski and Sacchi
(1987)和 Chao 等(2009)的方法进行总 RNA 的提取。
Trizol法：Trizol试剂购于上海生工生物工程有
限公司，参照试剂盒说明书进行总RNA的提取。
改良的异硫氰酸胍法：在传统方法中，植物材
料经过研磨分装后再加入变性液与 β -巯基乙醇，现
在改为研磨后，先加入变性液与 β -巯基乙醇，待完
全融化，研磨均匀后再进行分装；同时加大 β-巯基
乙醇的用量，由原来的 3.0 μL 变为 5.0 μL。
3.4 总 RNA 检测及纯度分析
1%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，
用 BioRad 凝胶成像系统拍照记录。
取 5 μL 总 RNA 溶液，加 0.1%DEPC 水至 500
μL，在紫外分光光度计上扫描，测定 230 nm、260 nm
和 280 nm 波长下的光密度值(D)，并用 D260/D280 及
D260/D230 的比值计算纯度。
RNA 产率(μg/g)=OD260×N (样品稀释倍数)×40
(μg/mL)×V( 体积)/样品重(g)(赵锦等, 2009)
3.5 cDNA-AFLP 分析
取 2 μg所提取的高羊茅总 RNA，采用 TaKaRa
公司的M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit试剂盒合
成双链cDNA，纯化后稀释20~50倍，之后用EcoR I
和 Mse I酶切，然后进行人工接头连接作为预扩增的
模板。预扩增产物稀释20倍后用于选择性扩增，扩
增产物经 8%聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染检测(王天
奎等, 2009)。
作者贡献
王康、李恩杰是本研究的实验设计和实验研究的执行
人；王康、李恩杰完成数据分析，论文初稿的写作；董洁参
与实验设计，试验结果分析；周禾是项目的构思者及负责人，
指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅
读并同意最终的文本。