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分子植物育种
(
网络版
), 2010
年
,
第
8
卷
,
第
5
篇
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2010, Vol.8, No.5
http://mpb.
5th
.sophiapublisher.com
共
8
页，第
2
页
2009; Huang et al., 2007)
等多个方向对青枯病的致
病机理开展了大量深入的研究。这些研究表明青枯
菌之所以能够引起多种植物的致死性枯萎，主要是
通过根、茎和伤口或次生根的根冠进入植物体后，
分泌大量胞外蛋白和多糖侵染寄主的木质部，然后
在整个维管束中蔓延，引起严重的萎焉最终导致植
物死亡
(Denny et al., 1990; Poueymiro and Genin,
2009)
。同时发现青枯菌分泌蛋白多为病原微生物与
植物受体蛋白起作用的激发子和其它致病因子
(Kang et al., 1994;
宋浩等
, 2010)
，所以分析这些分
泌蛋白的组成和功能对于人们认识烟草青枯菌的
致病机理和建立有效地防治手段有着重要的意义。
目前青枯菌
(GM1000
菌株
)
全基因组测序的完成
(Salanoubat et al., 2002)
，使得从蛋白质组水平分析
和研究该菌的致病机制成为可能。近年来，以不同
青枯菌菌株以及宿主为研究对象的比较蛋白质组
学研究已取得了一些新的进展
(Dahal et al., 2009;
Kang et al., 2008; Monchy et al., 2006;
宋浩等
,
2010)
，但尚未见有关利用蛋白质组学方法研究青枯
菌分泌蛋白的报道。随着蛋白质组学的日益发展，
利用现代质谱技术可以快速，有效，高通量地鉴定
生物样本的蛋白质。而蛋白质组学中常用的质谱
shotgun (
鸟枪法
)
技术可以通过对复杂的蛋白质样
品进行酶解形成肽段，经过广泛的分级后，由串联
质谱进行鉴定
(
夏其昌和曾嵘
,
科学出版社
,
pp.278)
，
shotgun
蛋白质组学技术已经成为研究复杂
蛋白质混合物的有力工具
(Wu and MacCoss, 2002)
。
本实验首次采用
shotgun
蛋白质组学技术对致病性
青枯菌分泌蛋白进行系统研究，为进一步阐述烟草
青枯菌的致病机理提供了实验数据和理论基础。
1
结果与分析
1.1
菌体的培养
在进行青枯菌菌体扩培前，参考陈晓敏等的方
法首先使用
2,3,5
-三苯基氯化四氮唑培养
(TTC)
琼
脂平板培养基从表型上验证其致病性，平行接种的
青枯菌菌体于
TTC
琼脂平板上
30
℃培养
(
陈晓敏等
,
2000)
，
48 h
后培养结果如图
1
显示，致病性菌株呈
现典型的周围光亮白边中心红点特征，结果与文献
报道的一致
(
李文溶和段遒雄
, 1988)
，说明本实验
图
1 TTC
琼脂平板培养基上的致病青枯菌
注
:
培养时间
: 48 h;
培养温度
: 30
℃
Figure 1 The pathogenic
Ralstonia solanacearum
on the TTC
agar medium
Note: The cultivate time was 48 h; The cultivate temperature
was 30
℃
所用菌体样品符合要求。
1.2
分泌蛋白质提取以及
SDS-PAGE
结果
致病性青枯菌接种于分泌培养基中，收集培养
基并用
Amicon Ultra
-
15 (
截留分子量
5 K)
超滤装置
浓缩超滤含有分泌蛋白的培养基后定量，结果在
200 mL
的分泌培养基中，致病青枯菌分泌了多达
50 µg
的蛋白质。致病性青枯菌培养基蛋白质
SDS-PAGE
电泳结果如图
2
所示：致病性青枯菌分
泌蛋白大部分集中在
27 KDa
与
97 KDa
之间，在
图
2
致病性青枯菌分泌蛋白质
SDS-PAGE
结果
注
: V:
致病青枯菌分泌蛋白
; M:
蛋白质分子量
Marker;
每
个泳道分成
5
个条带
Figure 2 The SDS-PAGE result of the pathogenic
Ralstonia
solanacearum
srcretory proteins
Note: V represents the srcretory proteins of pathogenic
Ralstonia solanacearum;
M represents protein molecular
weight marker; Each gel lane was divided into 5 regions