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分子植物育种
(
网络版
), 2010
年
,
第
8
卷
,
第
5
篇
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2010, Vol.8, No.5
http://mpb.
5th
.sophiapublisher.com
共
8
页，第
5
页
al., 2008)
、蛋白
B5SAX2 (Sun et al., 2009)
、外膜蛋
白
OmpW
和
OmpA/MotB
四种
(Sun et al., 2009)
、蛋白
PilA
和
PilT (Kang et al., 2002)
、蛋白
FtsN
、异青霉素
N
差向异构酶
(Derouaux et al., 2008)
、血溶素样蛋
白
Q8XT20/Q8Y2T5/Q8Y377/Q8Y378
三种
(Blum et
al., 1995)
。这些结果说明使用
shotgun
蛋白质组学技
术可有效的分析青枯菌分泌蛋白，具有可行性和有
效性。同时在这
384
个蛋白中，有
327
个迄今为止尚
无文献报道与青枯菌的致病性相关，有
40
个为未知
蛋白。这个结果一方面的原因可能是因为目前关于
青枯菌分泌蛋白的研究较少；另一方面是由于
shotgun
蛋白质组学技术较其他的传统蛋白检测手
段例如免疫杂交等或者传统的基于凝胶系统的
2D
技术具有更高的检测水平，可以检测到更多的低丰
度蛋白质
(Listgarten and Emili , 2005)
。这些首次鉴
定到的蛋白和未知蛋白都为烟草青枯菌致病性研
究及烟草青枯菌蛋白组数据库的建立积累了重要
资料，为进一步阐述烟草青枯菌的致病机理提供了
实验数据和理论基础，这也是我们下一步研究工作
的重点。
3
材料与方法
3.1
菌种培养
供 试 菌 株 为 茄 青 枯 雷 尔 氏 菌
(
Ralstonia
solanacearum
)
。根据细菌的生理生化特性，属于为
Race1 (Biovar 3)
品种，来自中国农科院。本供试菌
株为杆状，革兰氏染色阴性，参考陈晓敏的方法在
TTC
平板上
30
℃下划线培养
(
陈晓敏等
, 2000)
。
48 h
后，可出现两种不同的菌落：一种是中心呈粉红色
或浅色的稀液状、较宽的白边、不规则形或近圆形、
流动性强、致病力强的野生菌落；另一种是致病力
弱或丧失致病力的变异菌落，它们呈圆形、光滑、
干燥、较扁平、玫瑰红色、白边很窄
(
李文溶和段遒
雄
, 1988)
。挑取致病菌菌株
(virulent strain)
继续培养。
3.2
样品制备
致病性青枯菌分别接种于分泌培养基
(10
克酸
水解酪素
,
蒸馏水
1 000 mL, PH7.0~7.46) (
陈晓敏
等
, 2000)
中，
30
℃振荡培养
(200
转
/min) 48
小时，
当培养液
OD
600nm
=0.6
时将培养液以
6000
转
/min
离
心，收集上清。上清用
Amicon Ultra
-
15(
截留分子
量
5 K)
超滤装置浓缩至
1 mL
后加入
5 mL
预冷的丙
酮
(
含
1%
二硫苏糖醇
)
沉淀，沉淀产物冷冻干燥后加
入含
8M
尿素，
150 mM
甲基氨基甲烷，蛋白酶抑
制剂的裂解液
(pH8.5)
，
4
℃放置
30 min
后以
12 000
转
/min
于
4
℃离心
2
小时，取上清，上清用
GE
-
2D
除 盐 试剂 盒
(GE)
除盐 后以
Bradford
法 定量
(Bio-Rad)
。
3.3 SDS
-聚丙烯酰胺凝胶电泳以及酶解
致病菌株提取的分泌蛋白样品加入二硫苏糖
醇至终浓度
10 mmol/L
， 放置于
37
℃
2.5 h
后加入
碘乙酰胺至终浓度
50 mmol/L
，室温避光反应
40 min
。
还原和烷基化反应后的样品进行
SDS-PAGE
垂直电
泳
(12.5T%)
，每个泳道各上样
20 µg
。电泳条件为：
15 mA
电泳
20 min
后以
30 mA
电流直至溴酚蓝前
沿迁移至底端。
SDS-PAGE
胶经考马斯亮蓝
R
-
350
(GE)
染色后每组样品分成
5
份，每份条带首先用
50 mmol/L
碳酸氢胺
/30%
乙腈脱色，再用
100%
乙腈
处理
5 min
，干燥后加入
50 mmol/L
碳酸氢胺，
10 min
后弃去，再加入
100%
乙腈，
5 min
后弃去，干燥后
加入以蛋白
:
酶
=50:1
的比例加入胰蛋白酶
(Promega
Biotech Co., Madison, WI, USA)
，
37
℃
反应
12 h
。
酶解产物用
0.1% TFA/60%
乙腈超声抽提后冷冻干
燥，酶解样品于-
70
℃保存待用。
3.4 LC-MS/MS
酶解样品复溶于
0.1%
甲酸后用
MDLC
进行反
相
C18
-
HPLC (150×100 mm Column technology Inc.,
Fremont, CA)
分离，泵流速
65
微升
/
分钟。经由分流
器，柱出口流速为
2 µL/min
。流动相
A
为
0.1%
甲酸
/
水，流动相
B
为
84%
乙腈
/0.1%
甲酸
/
水。梯度设置如
下：
4%~50% B 105 min
，
100% B
维持
15 min
。
RP-HPLC
柱出口经由电喷雾接口
(ESI)
与
LTQ
线形
离子阱质谱相连，具体设置如下：加热毛细管温度
为
160
℃，
ESI needle
电压为
3.0 kV
，碰撞能量为
35.0%
。使用
AGC
模式采集信号，毛细管与四级杆
等参数由调谐程序自动优化，采集方式为
1
个全扫
描
(profile
模式
)
后对全扫描的
5
个相对最强离子进行
MS/MS
扫描，其中有动态排除设置
(
重复
2
次
,
重复
间隔
0.5 min,
排除间隔
1.5 min)
。