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分子植物育种
(
网络版
), 2010
年
,
第
8
卷
,
第
2
篇
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2010, Vol.8, No.2
http://mpb.
5th
.sophia
p
ublisher.com
共
5
页，第
4
页
cry1Ac
、
cry1C*
基因表现出对螟虫特别是稻纵卷叶
螟完全的抗性，其中，
cry2A*
基因对螟虫特别是稻
纵卷叶螟表现出较强的抗性，有个别叶片遭到损害，
这个结果与前人
(Chen
等
, 2005)
发表的结果相一致。
从农艺性状考察的结果看，转
Bt
基因
(
cry1Ac
,
cry1C*
和
cry2A*
)
的各个家系各个农艺性状与原始
9311
和辐恢
838
基本没有差异，同时在大田自然发
虫的情况下，大部分转
Bt
基因
(
cry1Ac
,
cry1C*
和
cry2A*
)
家系比对照在各个农艺性状上都有优势，但
是，有个别性状和个别转
Bt
基因家系比对照没有体
现出明显的优势。一方面，由于武汉
2009
年螟虫
和稻纵卷叶螟等害虫发虫并不是很严重；另一方
面，由于螟虫和稻纵卷叶螟等害虫发虫主要出现在
抽穗期以后，因此它们对水稻的危害适当的减轻。
以上两个因素可能是个别转
Bt
基因家系比对照没
有体现出明显优势的原因。
本研究的目的在于对本重点实验室设计合成
的三个
Bt
基因
(
cry1Ac
,
cry1C*
和
cry2A*
)
进行转育
并评价其表现；分子标记辅选择进行辅助育种，可
大大提高育种的效率，同时华中农业大学于
2009-11
获得转
Bt
基因华恢
1
号和
Bt
汕优
63
安全证书，此
安全证书批准的
Bt
为第一代
Bt
基因
(
cry1Ab/c
)
，本
研究也是建立在此基础上，同时利用本实验室合成
的第二代
Bt
基因
(
cry1C*
和
cry2A*
)
进行转育，为即
将到来的
Bt
基因商品化应用提供后备资源；绿色
超级稻是张启发在
2009
年提出的水稻战略设想
(Zhang, 2009)
，归纳起来为在不断提高产量和品质
的基础之上，实现基本不打农药，大量少施化肥和
抗旱节水的目标。本研究的目的是绿色超级稻实施
策略的第一步，即通过转基因的技术，借助分子标
记辅助选择，利用外缘基因实现水稻获得对危害其
生长发育及产量的害虫抗性。
3
材料与方法
3.1
供试材料
本试验研究的水稻材料为
(1)
供体亲本为本重
点实验室已构建好的
Bt
材料明恢
63 (
cry1Ac
)
、明
恢
63 (
cry1C*
)
和明恢
63 (
cry2A*
) (Tang
等
, 2006;
Chen
等
, 2005)
。
(2)
受体亲本为我国杂交水稻两系和
三系优良亲本材料
9311
和辐恢
838
，分别引自江苏
里下河地区农业科学研究和四川省原子核应用技
术研究所。
3.2
分子标记辅助回交的技术路线
利用本实验室已有的转
Bt
材料明恢
63
(
cry1Ac
)
、明恢
63 (
cry1C*
)
和明恢
63 (
cry2A*
)
作为
供体亲本，以
9311
和辐恢
838
分别作为受体亲本，
通过杂交并以受体亲本作为轮回亲本进行三代的
回交，获得背景与轮回亲本一致的转
Bt
基因家系，
最后通过自交一代来获得纯合转
Bt
基因家系。
3.3
田间种植
将回交三代，自交一代的转
Bt (
cry1Ac
,
cry1C*
和
cry2A*
)
基因的家系随机种植，每个家系种植
24
株，
对照亲本同样随机种植于转
Bt
基因家系中，共计
80
个转
Bt
基因家系。单株之间间隔为
16.5 cm×19.8 cm
，
家系之间间隔为
39.6 cm
。
3.4
分子标记
检测用到的不同
Bt
基因引物序列与
Tang
等
(2006)
和
Chen
等
(2005)
文献中利用的引物序列一
致，退火温度统一为
57
℃，
Bt
基因引物序列设计为
显性标记，只能鉴定阳性植株。
3.5 PCR
分子标记检测及琼脂糖凝胶电泳检测
水稻叶片总
DNA
的提取方法采用
CTAB
法
(Murray and Thompson, 1980)
。
PCR
反应程序：第
1
步
94
℃
4 min
变性，第
2
步
94
℃
50 s
变性，第
3
步
57
℃
50 s
退火，第
4
步
72
℃
55 s
延伸，第
5
步
72
℃
7 min
延伸，第
6
步
25
℃
1 min
终止冷却，第
2
步到第
5
步共
32
个循
环。利用
3%
的琼脂糖凝胶电泳检测
(250V, 30 min)
。
3.6
田间抗虫鉴定及农艺性状考察
抗虫鉴定：抽穗期，对所有转基因家系及亲本
对照进行自然发虫的虫害
(
稻纵卷叶螟
)
考察，每个
家系观察所有的
24
株，对虫害情况进行记录。
农艺性状考察：随机选取各个转
Bt (
cry1Ac
,
cry1C*
和
cry2A*
)
基因家系，每个基因型选取两个纯
合家系，每个纯合家系随机选取
5
株进行考种。