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分子植物育种
(
网络版
), 2010
年
,
第
8
卷
,
第
15
篇
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2010, Vol.8, No.15
http://mpb.
5th
.sophiapublisher.com
第
2
页，共
6
页
化失败；选择压偏小，将导致大量的假阳性转化体
产生，给以后的转化体筛选以及分子检测工作带来
不便。农杆菌介导的遗传转化中，受体材料与农杆
菌共培养后，农杆菌过度生长造成的污染将导致遗
传转化失败，因此需要在培养基中添加合适的抗生
素抑制农杆菌的继续生长，从而避免细菌污染。研
究表明，植物不同基因型对抗生素敏感反应不同
(
范
正琪等
, 2005)
，同种植物材料对不同的抗生素反应
也存在差异
(
康薇等
, 2008;
郑树松等
, 2002)
。因此对
受体材料对抗生素的敏感性进行研究以确定遗传转
化中合适的抗生素种类及使用浓度，从而降低筛选
难度，避免细菌污染，同时不影响转化体的正常生
长，是进行遗传转化并提高转化效率的保障。遗传
转化中使用的抗生素按照用途分主要有筛选抗生素
和抑菌抗生素两类。卡那霉素
(Kanamycin, Km)
属于
氨基葡萄糖苷类抗生素，由于
Km
对细胞具有强烈
的毒害作用，致使大量的非抗性受体材料经选择培
养后便慢慢死亡，因此
Km
经常被用作植物遗传转化
中的筛选抗生素。头孢霉素
(Cefotaxime, Cef)
和羧苄
青霉素
(Carbenicillin, Cb)
等常用作植物遗传转化中
的抑菌抗生素。大量遗传转化研究表明，
300
-
500 mg
的抑菌抗生素能够达到很好的抑菌效果
(Cerda
等
,
2002; Hiei
等
, 2006; Nigroa
等
, 2008)
。
植物体细胞胚胎是由胚性细胞发育而来，具有
很强的接受外源
DNA
的能力，体细胞胚多是单细胞
起源，转化获得的转基因嵌合体较少，是理想的基
因转化感受态细胞
(
陈英等
, 2006)
。在针叶树的遗传
转化研究中，用做转化的受体材料主要有胚性细胞、
体细胞胚、下胚轴、原生质体、种子、合子胚、茎、
花粉等，但是转化成功的报道中以胚性细胞为受体
材料居多，例如以胚性细胞为受体材料对辐射松
(
Pinus radiata
)
、火炬松
(
Pinus taeda
)
、挪威云杉
(
Picea abies
)
、黑云杉
(
Picea mariana
)
进行遗传转化已
经获得了稳定表达的转基因植株
(
陈少瑜等
, 2006)
。
因此高效的体胚再生系统是比较理想的遗传转化受
体系统。目前本课题组已经建立了稳定高效的落叶
松体细胞胚胎发生的体系
(
齐力旺
, 2000)
，是落叶松
遗传转化的优良受体系统，关于落叶松遗传转化的
研究可以开展。然而抗生素对落叶松细胞系生长影
响作用尚不清楚，相关的研究至今为止鲜有报道。
本文研究了
Km
、
Cef
、
Cb
对落叶松胚性细胞系增殖
与恢复生长的影响，目的在于确定落叶松胚性细胞
系遗传转化研究中合理的抗生素使用方案，为建立
基于落叶松体细胞胚胎发生技术的高效遗传转化体
系奠定基础。
1
结果与分析
1.1 Km
处理下细胞系
638
的生长
胚性组织于含有不同浓度
Km
的增殖培养基培
养
30 d
后，生长情况趋于稳定。经观察，组织对
Km
的反应比较敏感。随着
Km
浓度的增加，接种组织产
生新生细胞数量逐渐减少，生长状态也越来越差
(
图
1)
。当
Km
浓度为
15 mg/L
时，组织生长开始受到明显
的抑制，呈现褐色，表面仅有少数的存活细胞；当浓
度为
20 mg/L
时，组织褐化现象严重并呈水渍状，表
面只有零星细胞存活。随着浓度的增大
(
≥
25 mg/L)
，
组织呈严重水渍状，完全失去再生能力且逐渐死
亡。经过对组织增殖率的统计得知，随着
Km
浓度
的增大，组织增殖率逐渐下降；用
LSD
法对组织增
殖率进行多重比较结果表明
(
见表
1)
，胚性组织在
Km
的作用下增殖率与对照存在显著性差异，
Km
浓度≥
25mg/L
的处理间无显著差异。结合
Km
作用下组织生
长状态及组织增殖率分析，
Km
浓度为
25 mg/L
时细
胞系
638
耐受性已经达到临界程度。
1.2 Km
处理下细胞系
109
的生长
统计结果表明，随着
Km
浓度的增大，细胞系
109
组织增殖率逐渐降低。对不同浓度
Km
处理下胚性组
织的增殖率进行
LSD
法多重比较
(
见表
1)
得出，各处
理与对照存在显著性差异，较高浓度
(15
-
25 mg/L)
的各处理差异不显著。通过观察各处理下胚性组织
生长状态可知，当
Km
浓度为
15 mg/L
时，组织已经
开始受到严重的伤害；浓度≥
20 mg/L
时，生长完全
被抑制，且全部死亡。由此看来，细胞系
109
对
Km
耐受性临界浓度为
20 mg/L
。
1.3 Km
处理下细胞系
113
的生长
细胞系
113
对
Km
的反应与另外两个细胞系相
比更加敏感。经
Km
处理后，该细胞系组织增殖率
明显低于不经处理的组织。
LSD
法多重比较结果表
明
(
表
1)
：胚性组织在
Km
的作用下增殖率与对照存在
显著性差异；不同浓度
Km
作用下，胚性组织的增殖