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分子植物育种
(
网络版
), 2010
年
,
第
8
卷
,
第
1
1
篇
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2010, Vol.8, No.1
1
http://mpb.
5th
.sophiapublisher.com
共
10
页，第
2
页
区，台风频繁且又主要集中在香蕉迅速生长发育
期，风害威胁着我国的香蕉产业的发展。因此，选
育出矮杆抗风，根系发达的香蕉新品系是香蕉的育
种目标之一。由于大多数香蕉栽培品种不育性和多
倍性，难以通过常规育种方式进行种质改良，基因
工程技术为香蕉育种提供了新的途径。
诱根质粒
(Root inducing plasmid, Ri)
来源于发
根农杆菌
(
Agrobacterium
rhizogenes
)
，其中农杆碱型
Ri
质粒的
TL-DNA
上至少含有
4
个与毛根诱导有关
的基因位点即
rol
(root loci)A
、
B
、
C
和
D(White et al.,
1985)
。其中
rolC
基因是改良植物性状的重要基因，
在园艺植物品种改良中有很大的应用价值。该基因
转化烟草
(
章镇等，
2001)
，猕猴桃
(Rugini et al.,
1991)
、苹果
(
丛郁等，
2006)
、枳橙
(
胡春华等，
2006)
中，转基因植株均表现顶端优势减弱、分枝增多，
节间缩短，树冠矮化紧凑，同时，转基因植株生根
能力大大提高，根系活力增强。
本试验拟将
Ri
质粒上决定植物毛根形成并
影响植株形态的
rolC
基因进行克隆并将其转入到
野 生 蕉 胚 性 细 胞 悬 浮 系
(embryogenic cell
suspensions, ECS)
中，通过对转基因香蕉的分子鉴
定和外源基因表达分析以及形态学等方面的观
测，探求
rolC
基因对野生蕉生物学特性的影响，
以期为下一阶段利用该基因转化香蕉栽培品种，
为筛选出矮化、根系发达的香蕉新种质提供技术
参考。
1
结果与分析
1.1
植物表达载体
pCB121
的构建
将植物表达载体
pBI121
用
Hin
d
Ⅲ
和
Eco
R
Ⅰ
双酶切回收后的小片段
(35S-GUS-NOSt)
与经过
相同双酶切的
pCAMBIA1301
大片段进行连接，
转化大肠杆菌感受态
DH5α
，在附加
50 mg/L
卡那
霉素的
LB
琼脂平板上长出了阳性菌落，挑单菌
落摇菌，少量提取重组质粒并用
Hin
d
Ⅲ
和
Eco
R
Ⅰ
双酶切，可以切下约
3 kb
的与预期大小相
符的片段
(
图
1)
，表明植物表达载体
pBI121
上的
双 酶 切 小 片 段
(35S-GUS-NOSt)
成 功 插 入 到
pCAMBIA1301
的预期位点。重组植物表达载体
命名为
pCB121
。
图
1 pCB121
质粒双酶切鉴定
注
: 1-3: pCB121
质粒
Hin
d
Ⅲ
和
Eco
R
Ⅰ
双酶切
M: 100 bp
DNAMarker
Figure 1 Identification of recombinant plasmid pCB121 with
digestion
Note: 1-3: pCB121 plasmid restricted by
Hin
d and
Ⅲ
Eco
R ;
Ⅰ
M: 100 bp DNAMarker
1.2
rolC
基因的克隆及植物表达载体构建
以
Ri
质粒为模板，以
rolC
特异引物进行
PCR
扩增，
PCR
扩增产物经电泳获得
1
条约
550 bp
的条
带
(
图
2)
，与预期大小一致。回收并将其克隆到
pGEM-T
载体中获得重组质粒
pGEM-
rolC
。测序结
果表明，获得了
rolC
基因包含起始密码子和终止密
码子在内的完整的编码区，序列与
GenBank
公布的
rolC
基因
(GenBank accession No. X64255)
序列完全
一致。
图
2
rolC
基因
PCR
扩增图
注
: M: 100 bp DNA
分子量标记；
1~3
：
rolC
基因
PCR
产物
Figure 2 PCR amplification of the
rolC
gene
Note: M: 100 bp DNA marker; 1-3: PCR products of
rolC
将
rolC
基因用
Xba
Ⅰ
和
Sac
Ⅰ
双酶切从
pGEM-
rolC
质粒中切下，与经过相同双酶切的植物
表达载体
pCB121
连接，转化大肠杆菌感受态
DH5α
，挑阳性菌落摇菌提取质粒，用
Xba
Ⅰ
和
Sac
Ⅰ
双酶切，可以释放出
1
条约
550 bp
的条带
(
图
3)
，结果表明，该重组质粒即为所需阳性克隆，并
将其命名为
pCB121-
rolC
。
1.3
rolC
基因对野生蕉
ECS
的转化与再生芽生根
采用农杆菌介导法进行
rolC
基因转化野生蕉。
野生蕉悬浮系与含
rolC
基因的农杆菌共培
4 d
后，
经过
GUS
基因检测即可检测到
GUS
基因的表达。