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分子植物育种 (网络版), 2010 年, 第 8 卷 , 第 11 篇
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2010, Vol.8, No.11
http://mpb. 5th .sophiapublisher.com
共 10 页，第 5 页
pCAMBIA1301，根癌农杆菌菌株 EHA105，大肠杆
菌菌株 DH5α 及 Ri 质粒等均为本试验室保存。植物
材料野生蕉( Musa itinerans Cheesm.) 胚性细胞悬
浮系根据魏岳荣等(2006) 利用未成熟合子胚诱导
获得。
RNA 提取试剂 Trizol Reagent 购自 Invitrogen
公司，pGEM-T 载体购自 Promega 公司，T4 DNA
连接酶、限制性内切酶以及反转录酶 AMVRTase 均
购自 TaKaRa 公司，琼脂糖 DNA 回收试剂盒购自天
根生化公司，其它化学试剂均为国产分析纯。
3.2 引物设计
根据 GenBank 公布的 rolC 基因 (GenBank
accession No. X64255)序列，设计一对特异性引物：
5′-gactctagaatggctgaagacgacctgtgt-3′;5′-cggagctcgccgat
tgcaaacttgcactc-3′，其中，上游引物和下游引物分别
引入 Xba Ⅰ 和 SacⅠ 内切酶位点并加保护性碱基，
引物由上海生工生物工程技术公司合成。
3.3 植物表达载体 pCB121 的构建
植物表达载体 pBI121 用 Hind Ⅲ和 EcoRⅠ 完
全双酶切，电泳回收 pBI121 双酶切约 3kb 的小片
段(35S-GUS-NOSt)，并将其克隆到经过相同酶切的
pCAMBIA1301 上，转化大肠杆菌 DH5α 感受态，
提取质粒，对重组质粒进行酶切鉴定，将经过鉴定
的重组子命名为 pCB121。
3.4 rolC 基因的克隆及植物表达载体构建
以 Ri 质粒为模板进行特异引物的 PCR 扩增。
PCR 扩增产物利用 DNA 回收试剂盒 (购自天根生化
公司)回收。将回收目的片段与 pGEM-T 载体(购自
Promega 公司) 连接，连接产物转化大肠杆菌 DH5α
感受态细胞，蓝白斑筛选获得阳性克隆，取阳性克
隆送上海生工生物工程技术公司测序。测序结果经
BLAST 检索序列数据库，确定所克隆的序列为 rolC
基因编码序列。之后用 XbaⅠ 和 Sac Ⅰ双酶切将 rolC
基因从 T 载体中切下，回收酶切目的基因片段，将
其克隆到植物表达载体 pCB121 的 XbaⅠ 和 SacⅠ 位
点，用特异引物对重组质粒进行 PCR 鉴定和 XbaⅠ
和 Sac Ⅰ双酶切鉴定，鉴定正确的阳性质粒重命名
为 pCB121-rolC，质粒 pCB121-rolC 用冻融法转化
根癌农杆菌菌株 EHA105 。
3.5 rolC 基因转化野生蕉胚性细胞悬浮系
以继代保持在 M2 液体培养基中野生蕉胚性悬
浮细胞系为转化受体，利用农杆菌介导法将 rolC 基
因转到野生蕉中。遗传转化及植株再生参照胡春华
等 (2010b)的方法进行。
3.6 GUS 基因的检测
取与农杆菌共培养 4 d 之后的 ECS、液体筛选
培养的各代抗性 ECS 、再生抗性胚以及再生苗的叶
和根进行 GUS 组织染色鉴定，以相应的未经转化
的材料做对照。 GUS 基因瞬时表达检测参照
Jefferson (1987)的组织化学染色法方法进行。
3.7 PCR 分子鉴定
取经过 GUS 基因检测为阳性的再生香蕉叶片
及对照叶片，采用改良 CTAB 方法( 胡春华等, 2006)
提取 DNA，用 rolC 基因特异引物进行 PCR 扩增。
PCR 产物用 1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统照
相，检测 PCR 结果。
3.8 RT-PCR 检测 rolC 基因表达
取 GUS 染色和 PCR 鉴定均为阳性的转化再生
苗及对照苗的新鲜叶片，用 Trizol Reagent 试剂(购
自 invitrogen 公司) 提取总 RNA，以 oligo (dT)为引
物合成 cDNA 第一链，再按照如下的 PCR 反应体
系和程序进行 PCR 扩增。 PCR 反应体系为 25 μL ：
其中 4μL dNTPs (1mmol/l)，10×PCR Buffer 2.5 μL，
上、下游特异引物(10 μmol/μL)各 1.5 μL，反转录合
成的 cDNA 1 μL，Taq DNA 聚合酶 0.3 μL（3U/μL），
ddH2O 14.2 μL。 PCR 反应程序为：94 ℃预变性 5
min ；然后 94 ℃变性 30 sec，55 ℃退火 30 sec，72 ℃
延伸 60 sec，35 个循环，最后 72 ℃ 延伸 10 min。
PCR 扩增产物于 1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。
作者贡献
胡春华，邵秀红，刘凯是本研究的实验设计和实验研
究的执行人；魏岳荣是试验植物材料的提供人；胡春华完成
数据分析，论文初稿的写作；黄永红参与实验设计，试验结
果分析；胡春华，易干军是项目的构思者及负责人，指导实
验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同
意最终的文本。