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医学遗传学与疾病研究
(
网络版
), 2012
年
,
第
1
卷
,
第
2
篇
,
第
1
-
5
页
Yixue Yichuanxue Yu Jibing Yanjiu (Online), 2012, Vol.1, No.2, 1
-
5
http://mgdr.5th.sophiapublisher.com
17
稳定存在的
miRNAs
可能包被于
Exosome
中。
Exosome
是一类直径约
30~100 nm (
张尧和吴小候
,
2008)
广泛存在各种体液中的小囊泡体
(Lakkaraju
and Rodriguez-Boulan, 2008)
，可以保护其中包被的
miRNA
、
mRNA
和蛋白质，还能参与细胞之间信息
的传递和物质的交换
(Mathivanan et al., 2010)
，甚至
在植物性食品和人体之间进行交流
(Zhang et al.,
2012)
。显然，婴儿喝下母乳后，其中含有的免疫相
关
miRNAs
很可能通过这种保护机制抵御胃肠道的
消化而直接被机体吸收，进而对婴儿自身免疫系统
的完善发挥其调控作用。本研究结果进一步为核酸
营养和母乳喂养重要性提供了佐证。
3
材料与方法
3.1
样本采集
人乳汁
(20~50 mL)
取自
4
名产后
60 d
处于泌乳
期的健康妇女
((30
±
0.9)
岁
,
第一胎
,
自然分娩
)
，用
手动吸乳器收集乳汁于无菌离心管中。收集好的样
品于
-80
℃冻存，用于研究分析。
3.2
样本处理
将人乳汁冰上解冻后混合均匀，取等量样本分
别模拟储存：
(1) 26
℃孵育
0.5 h
、
1 h
、
2 h
、
4 h
、
8 h
和
24 h
；
(2) -20
℃和室温反复冻融
6
次；
(3) 100
℃孵
育
10 min
，和模拟体内消化：
(4) RNase A (0.16 µg/µL)
和
RNase T1 (0.4 U/µL) (
美国
Fermentas
公司
) 37
℃
孵育
1 h
。样本在处理前都加入
100 fM
外源性
miRNA ath-miR-159a-3p (
广州锐博公司人工合成的
miRNA,
与人体内
miRNA
无同源性
)
，作为内源性
miRNAs
的对照。样本处理结束后，为校正不同样
本在
RNA
抽提以及后续实验中的误差，在乳汁变
性后
(RNA
抽提过程中加入裂解液后
)
加入
100 fM
外源参考基因
cel-miR-2-3p
和
cel-lin-4-5p
。
3.3 qRT-PCR
检测人乳汁中免疫相关
miRNAs
qRT-PCR
检测人乳汁中
9
个内源性的免疫相关
miRNAs
和一个外源
miRNA (ath-miR-159a-3p)
的相
对表达量，
miRNAs
的引物即为其成熟体本身，序
列查自
miRBase 18.0
数据库
(http://www.mirbase.
org/)
。荧光定量参照
SsoFast
™
EvaGreen® Supermix
说明书
(
美国
Bio-Rad
公司
)
进行操作。
qRT-PCR
反
应体系为
10 µL
：
5 µL SsoFast EvaGreen supermix
，
0.5 µL
引物，
1 µL
的
cDNA
模板。
PCR
循环参数为：
98
℃
30 s
，
98
℃
1 s
，
60
℃
5 s
，循环
45
次，
PCR
扩增后进行熔解曲线分析，温度以
0.2
℃
/s
的速度缓
慢从
65
℃递增到
95
℃，每个
miRNA
做
3
个技术重
复，每板设置一个阴性对照。检测仪器为
Bio-Rad
的
CFX96
™实时
PCR
检测系统
(
美国
Bio-Rad
公司
)
。
以外源性的
miRNAs cel-miR-2-3p
和
cel-lin-4-5p
作
为校正不同样品的参考基因，采用
2
-
ΔΔ
Ct
法计算
miRNAs
相对表达量差异，并采用
SigmaPlot
软件
(
美
国
Systat
公司
)
进行
Student-t
检验。
作者贡献
周琦负责试验设计和文章的写作；王晓艳在实
验操作中提供帮助和指导；李青芝负责实验样本的
采集工作；王滔在本论文数据处理方面做了大量工
作；蒋岸岸在本论文写作及修改上面做了大量工作。
致谢
本研究获得国家自然科学基金项目
(30901024)
资助。作者感谢四川农业大学动物遗传研究所为本试
验开展提供实验室和仪器；本论文的完成要感谢李明
洲和官久强等的热情帮助。在此对他们表示感谢！
参考文献
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