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计算分子生物(网络版), 2012 年, 第 1 卷, 第 1 -6 页
Jisuan Fenzi Shengwu (Online), 2012, Vol.1, 1- 6
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参与了损伤 DNA 所在的染色质结构的松散，提高损
伤 DNA 的修复效率。在接下来的研究中，我们将针
对损伤部位核小体松散的程度进行检测，观察 BRG1
的 ATP 酶活性对损伤后核小体结构调整的影响。
3 材料和方法
3.1 材料
人宫颈癌细胞株 HeLa 和人肾上腺皮质腺癌细
胞株 SW13 购自上海细胞研究所细胞库。
IMDM 培养基购自 Invitrogen 公司；四季青胎
牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；兔
源 抗 BRG1 单 克 隆 抗 体 (SMTRCA4) 购 自 于
Santacruz 公司；鼠源 Tubulin 单克隆抗体 (AR819)
购自 Sigma 公司；二抗分别为山羊抗小鼠 IgG 和山
羊抗兔 IgG，均为 Santacruz 公司产品；ECL 发光液
购自 GE Health 公司；凯基细胞凋亡检测试剂盒购
自南京生物科技发展有限公司。
绿色荧光蛋白质量 GFP；BRG1 真核表达质粒
pBJ5-BRG1 和载体质粒 pBJ5 (Dr. Keji Zhao, NIH,
Maryland 惠赠) 。
3.2 细胞培养
人宫颈癌细胞株 HeLa 和人肾上腺皮质腺癌细胞
株 SW13 及用含有 10% 胎牛血清、青霉素(100μg/mL)
和链霉素(0.01 g/mL)的 IMDM 培养基于 37℃、5% CO2
的培养箱中培养。
3.3 脂质体瞬时转染
转染 24 h ，将 0.5~2×10 5 细胞接种到 500 L 不
含抗生素的培养基中，使转染时细胞密度达到
90%~95%。0.8 g DNA 50 L 无血清培养基中。轻混
lipofectamineTM 2000，取 2.0 L 混入 50 L 无血清培
养基中，温育 5 min。将混合 DNA 和 lipofectamine。
作用 20 min 后将 100 L 混合物加入每个含细胞的
小室内，轻混。37℃培养，转染 4~6 h 后可换液，
18~48 h 后检测。
3.4 核蛋白的提取
待细胞丰度达到 75%~80%时，用胰酶消化并
收集细胞，1000 r/min 离心 5 min，去上清。将沉淀
重悬于 PBS 中，1500 r/min 离心 5 min 。将沉淀重
悬于 400 L 冰冷的缓冲液 A (10 mmol/L Hepes-KOH,
pH 7.9, 1.5 mmol/L MgCl2, 10 mmol/L KCl, 1 mmol/L
DTT, PMSF)，置冰上冰浴 30 min，NP-40 添加至终体
积的 0.6% (V/V)，剧烈振荡 10 s，置冰上冰浴 30 min。
将沉淀的细胞核重悬于缓冲液 B ( 20 mmol/L
Hepes-KOH, pH 7.9, 1.5 mmol/L MgCl2, 400 mmol/L
NaCl, 0.5 mmol/L EDTA, 25%甘油, 1 mmol/L DTT,
PMSF)，置于 4℃摇床剧烈摇动 30 s，13 000 r/min 离
心 5 min，核蛋白上清液于-70℃ 保存。
3.5 Western bloting 分析
将样品进行 SDS-PAGE ，经电转移至硝酸纤维
素膜，5%脱脂奶粉室温封闭 1 h，弃溶液，加入 TBST
稀释的一抗，室温轻摇 1 h；TBST 洗 3 次后，加入
5% BSA 稀释的二抗，室温轻摇 1 h， TBST 洗 3 次
后；用 ECL 显色 5 min，压片显影。
3.6 流式细胞仪检测凋亡
用胰酶消化并收集细胞。PBS 洗涤细胞二次。
收集细胞，将 5 LAnnexinV-FITC 加入到含有 500 L
Binding Buffer 的细胞悬液中混匀，然后加入 5 L
propidium Iodide 混匀，25℃避光 5~15 min 。反应结
束后利用流式细胞仪检测。
作者贡献
通讯作者曾宪录为本研究提供了实验平台及整体的研
究框架和思路，并对论文进行了修改和定稿；王晓光进行了
实验设计并撰写论文；王蕊进行了流式检测；王玲对本文文
字和图片进行了编辑。
致谢
感谢美国 Maryland 的 NIH 中心的 Keji Zhao 先生惠赠
BRG1 真核表达质粒 pBJ5-BRG1 和载体质粒 pBJ5。本研究
由国家自然科学基金 (90608021) 、吉林省自然科学基金
(201112165)和吉林省教育厅科研基金(吉教科合字 2012 第
221 号)共同资助。
参考文献
Alessio N., Squillaro T., Cipollaro M., Bagella L., Giordano A.,
and Galderisi U., 2010, The BRG1 ATPase of chromatin
remodeling complexes is involved in modulation of
mesenchymal stem cell senescence through RB-P53
pathways, Oncogene, 29(40): 5452-5463 http://dx.doi.org/
10.1038/onc.2010.285 PMid:20697355
Bergink S., Salomons F.A., Hoogstraten D., Groothuis T.A., de
Waard H., Wu J., Yuan L., Citterio E., Houtsmuller A.B.,
Neefjes J., Hoeijmakers J.H., Vermeulen W., and Dantuma
N.P., 2006, DNA damage triggers nucleotide excision
repair-dependent monoubiquitylation of histone H2A,
Genes Dev., 20(10): 1343-1352 http://dx.doi.org/10.1101/