昆虫分子生物学研究
(
网络版
), 2012
年
,
第
1
卷
,
第
1
篇
,
第
1
-
7
页
Kunchong Fenzi Shengwuxue Yanjiu (Online), 2012, Vol.1, No.1, 1
-
7
2
3-
羟酰辅酶
A
脱氢酶是一类氧化还原酶，主要
参与线粒体脂肪酸氧化过程。这类酶催化线粒体脂
肪酸氧化的第三步，将
3-
羟酰基
-
辅酶
A
脂类转移到
相应的
3-
酮脂酰
CoA
脂类上。
3-
羟酰辅酶
A
脱氢酶属
于线粒体三功能蛋白
(
MTP)
的一部分，其中包含烯
酰辅酶
A
水合酶和硫解酶活性
(
Carpenter et al., 1992;
Uchida et al., 1992)
。
根据
β
氧化中脂肪酸的碳链长
度，
3-
羟酰辅酶
A
脱氢酶可分为长链
3-
羟酰辅酶
A
脱
氢酶、中链
3-
羟酰辅酶
A
脱氢酶和短链
3-
羟酰辅酶
A
脱氢酶。迄今为止，研究最为深入的是
3-
羟酰辅酶
A
脱氢酶活性的缺失。长链
3-
羟酰辅酶
A
脱氢酶的活
性的缺失是由于线粒体三功能蛋白部分突变导致
酶活性的降低或丧失，例如，
G985A
基因和
G1528C
基因的突变
(
IJlst et al., 1997)
。
然而，短链
3-
羟酰辅
酶
A
脱氢酶活性的缺失涉及
Schad
基因的突变
(
Eaton
et al., 2003)
。
经临床研究表明，
3-
羟酰辅酶
A
脱氢酶
活性的缺乏主要导致低血糖症
(
den Boer et al., 2002)
。
家蚕质型多角体病毒
(
Bombyx mori
cytoplasmic
polyhedrosis virus, BmCPV)
属 呼 肠 孤 病 毒 科
(
Reoviridae)
。
其基因组由
10
节段
dsRNA
组成，根
据基因组
dsRNA
电泳谱，目前把质型多角体病毒
分成
12
个电泳型，家蚕质型多角体病毒为
I
型。该
病毒是家蚕的主要病毒病原之一，常给养蚕业带来
巨大的经济损失
(
Ikeda et al., 2001; Qanungo et al.,
2002)
。
目前，有关家蚕对
BmCPV
的防御机制的研
究报道很少。以寻找家蚕感染质型多角体病毒相关
应答基因为前提，正确理解病毒对家蚕感染致病的
分子机制，对家蚕质型多角体病的防控及蚕药的研
发具有重要的意义。
本实验室利用基因芯片
(
gene chip)
技术分析家
蚕感染
BmCPV
相关基因时，检测到了
3-
羟酰辅酶
A
脱氢酶蛋白基因的表达下调
(
Wu et al., 2011)
。
本
研究克隆了家蚕的
3-
羟酰辅酶
A
脱氢酶蛋白基因的
全长
cDNA
，
将其命名为
Bm3HAD
，
分析了基因结
构，并运用荧光定量
PCR
方法检测了该基因在正常
家蚕及
BmCPV
感染家蚕中肠组织中的差异性表
达，为深入研究该基因在家蚕对
BmCPV
感染应答
调控中的作用奠定了基础。
1
结果与分析
1.1
Bm3HAD
基因的
5’
端与
3’
端克隆
根据家蚕
Bm3HAD
基因
EST
序列，以合成的第
一链
cDNA
为模板，应用
RACE
方法，克隆获得该
基因
EST
序列的
5’
端和
3’
端
RACE
产物，
1%
琼脂
糖凝胶电泳检测结果，测序结果证明为目的序列。
由图
1
A
和图
1
B
可看出，
Bm3HAD
5’
端与
3’
端扩
增结果良好，
5’
扩增片段约为
250
~500 bp
，
3’
扩增
片段约为
1 000
bp
。
1.2
Bm3HAD
基因的序列与结构分析
1.2.1
Bm3HAD
基因全长
cDNA
序列分析
利用
RACE
技术克隆获得
Bm3HAD
基因，该基
因全长
cDNA
为
1 168
bp
，
其中包含
83
bp
的
5’
非翻
译区和
155
bp
的
3’
非翻译区，开放阅读框
930
bp
，
编
码
310
个氨基酸
(
图
2)
。
GenBank
登录号为
HQ833817
。
1.2.2
Bm3HAD
基因结构分析
应用
Blastn (NCBI,
克
图
1
Bm3HAD
基因的
3
’
端与基因的
5’
端的
PCR
扩增结果
注
:
M: DNAMarker; 1: 5’
端扩增产物
Figure 1 Amplification result of the 5’ end of
Bm3HAD
Note: M: DNAMarker; 1: 5’ end product
隆获得的家蚕
Bm3HAD
基因全长
cDNA
序列与家
蚕基因组数据库进行比对，发现该序列位于登录号
为
BABH01027674.1
的家蚕基因组序列内。根据比
对结果，从该序列中提取了
12 794
~19 585 bp
的序
列片段，对
Bm3HAD
基因进行结构分析。结果表明
该基因包含
5
个外显子，
4
个内含子，第
5
外显子
为最大，长度
368
bp
，
第
3
外显子最小，为
83
bp
，
见图
3
。
外显子与内含子交界处均符合
“
GT-AG”
剪
切规则。外显子的大小与位置见表
1
。
1.2.3
蛋白质一级结构分析
采用
ProtParam
软件
html)
对
Bm3HAD
基因编码的蛋白质进行一级结构
预测，结果表明家蚕
Bm3HAD
基因编码
310
个氨基
酸，其分子量约为
33.6
KD
，
等电点为
9.0
，
不稳定
指数为
21.34
，
提示该蛋白为一个稳定蛋白。在家
蚕
Bm3HAD
基因编码的蛋白质氨基酸组成中，相对
较多的氨基酸包括
Lys (32
个
, 10.3%)
、
Val (29
个
,
9.4%)
、
Ala (26
个
, 8.4%)
和
Gly (26
个
, 8.4%)
，
氨基
酸组成如表
2
所示。
