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基因组学与医学生物学
(
网络版
), 2012
年
,
第
1
卷
,
第
7
-
17
页
Jiyinzuxue Yu Yixue Shengwuxue (Online), 2012, Vol.1, 7
-
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8
其生产附带物内毒素与热原质的纯化过程也相当复
杂
(Anderson, 2010)
，诸多因素限制了传统疫苗的广泛
应用。
随着分子生物学的发展，植物转基因技术如日中
天。植物作为可再生资源，能够通过基因改造来表达
外源蛋白，并提供正确组装、折叠所需要的分子伴侣
等。利用植物生物反应器表达疫苗的研究日臻成熟并
展示出操作方便、成本经济、应用范围广等优势。然
而传统的核基因组转化中外源基因的表达效率偏低，
及转基因的逃逸现象成为现阶段限制植物疫苗发展
的瓶颈环节，而叶绿体转化技术的兴起与发展，为将
来生产廉价、安全的植物疫苗提供了新思路。它突破
了核基因组转化外源基因表达低效、易随花粉逃逸两
大障碍，具有高效表达、定点整合、母性遗传等优点
(Maliga, 2002; Wang et al., 2009; Bock and Warzechr,
2010; Maliga and Bock, 2011; Cui et al., 2011)
。本文在
对叶绿体转化技术简要介绍的基础上，阐述了叶绿体
转化在疫苗抗原的高效表达和物种扩展方面的研究
进展，重点对近年来通过该技术表达的一些重要的病
毒抗原和细菌抗原进行综述，对叶绿体转化技术在表
达外源蛋白方面存在的问题进行分析，并探讨植物疫
苗研究的未来发展方向。
1
叶绿体遗传转化技术概述
1988
年
Boynton
等
(1988)
用野生型叶绿体
DNA
转化衣藻突变体，使其光合能力完全被恢复，首次证
明叶绿体基因组可以被转化。历经
20
多年的研究与
发展，叶绿体基因工程在技术和应用上都取得了可喜
的进步，以下仅对叶绿体遗传转化的原理、转化方法
及其优点进行简要介绍。
1.1
叶绿体遗传转化的原理
叶绿体转化是对植物叶绿体基因组进行的遗传
转化，基本原理是通过目的基因两端连接的叶绿体同
源片段与叶绿体基因组发生同源重组双交换，将目的
基因整合进入叶绿体基因组，并经转录、翻译、折叠、
修饰等获得功能产物。成功的叶绿体遗传转化有
3
个
技术关键：
第一，构建表达载体时使用叶绿体来源的调控序
列实现外源基因在叶绿体的高效表达。叶绿体中外源
基 因 的 表 达 水 平 受 启 动 子 及
5’
非 翻 译 区
(5’-untranslated regions, 5’-UTR)
，包括核糖体结合位
点
(ribosomal binding site, RBS)
等 元 件 的 调 控
(Gruissem and Tonkyn, 1993)
，用来保证目的基因能转
录成高水平的
mRNA
。叶绿体
16S rDNA
基因的强启
动子
Prrn (Kota et al., 1999)
和光系统
Ⅱ
作用中心的启
动子
PpsbA (Staub et al., 2000)
是最常使用的启动子；
其次，目的基因阅读框两侧的
5’-UTR
和
3’
非翻译区
(3’-untranslated regions, 3’-UTR)
的序列或结构因子可
以与特异蛋白质结合而影响
RNA
的成熟和稳定性，
并成为影响转基因翻译的关键。通常在构建叶绿体表
达载体时选用叶绿体基因
psbA
的
5’-UTR
和
3’-UTR
(Verma and Daniell, 2007)
，保证转基因的高水平翻译。
第二，同源重组实现目的基因的定点整合。在构
建叶绿体表达载体时，为避免位置效应，且不破坏叶
绿体基因的原有功能，通常选用叶绿体基因组中相邻
的两个基因作为同源重组片段
(
一般为
1~2 kb)
，两基
因间隔区作为外源基因整合位点。外源基因可以在叶
绿体环状基因组的多个位点上表达，到目前为止，叶
绿体转化使用过的位点有
16
个，如
rbcL/accD
、
trnV/
rps7
、
psbA/trnK
、
atpB/rbcL
等
(Cui et al., 2011; Maliga
and Bock, 2011)
。
第三，叶绿体转基因个体基因组的同质化是其稳
定遗传的前提。叶绿体基因组的高拷贝是其优点，也
是其缺点，高拷贝性决定了外源基因几乎不可能同时
转化所有叶绿体基因组，极易出现转化的与未转化的
叶绿体组成的异质体。为了保证转基因在后代中的稳
定遗传，在转化过程中必须淘汰未被转化的叶绿体基
因拷贝，通常在构建叶绿体表达载体时连入筛选标记
基因，转化后在高浓度选择压力下进行多轮次抗性筛
选 ， 从 而 实 现 叶 绿 体 基 因 组 的 同 质 化
(Kittiwongwattana et al., 2007)
。
aadA
基因是目前叶绿
体转化中应用最广泛、筛选效率最高的抗生素类筛选
标记基因
(Svab and Maliga, 1993)
，其编码的氨基糖苷
-3-
腺苷酸转移酶能使转化植株具有壮观霉素和链霉
素抗性，在筛选过程中能够将绿色的转化细胞和白化
的非转化细胞区分开。此外，
nptII
基因
(Carrer et al.,
1993)
、
neo
基因
(Kuroda and Maliga, 2001)
、细菌
bar
基因
(Lutz et al., 2001)
等也相继用作叶绿体转化的筛
选标记基因，但转化效率均较
aadA
基因要低很多，
目前仍以
aadA
使用最为广泛。
1.2
叶绿体遗传转化的方法
用于叶绿体遗传转化的方法主要有：农杆菌介导
法、基因枪轰击法、
PEG
融合法、花粉管导入法、显
微注射法和电激法。其中使用最多、最成熟、最高效
的方法是基因枪法，即将外源
DNA
包被在微小的金