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基因组学与医学生物学
(
网络版
), 2012
年
,
第
1
卷
,
第
1
-
6
页
Jiyinzuxue Yu Yixue Shengwuxue (Online), 2012, Vol.1, 1
-
6
http://gmb.5th.sophiapublisher.com
4
TaKaRa
公司。
3.2
仪器与试剂
质粒提取试剂盒、
DL2000
分子量
Marker
购自
TaKaRa
公司；氨苄青霉素、卡那霉素、
IPTG
均购自
Sigma
公司，其它常规试剂均为分析纯级。
3.3
基因克隆与表达载体的构建
3.3.1 pMD19-T-His-SUMO-ALDH2
克隆载体的构建
根据人
ALDH2
的基因序列
(GenBank
登录号
:
JF432260)
和
His-SUMO
标签蛋白的基因序列
(GenBank
登录号
: GU456634)
，设计如下引物
F1
、
R1
、
F2
、
R2
。
F1
含有
Nde I
酶切位点
(
下划线
)
，以利于与
载体
pET28a(
＋
)
相连，
R1
含有
NspV
位点
(
下划线
)
，
以利于与
ALDH2
基因的连接，
R1
中同时含有
SUMO
蛋白酶的酶切位点，以利于将
SUMO
蛋白从目的片段
上切割下来；
F2
中含有
NspV
位点
(
下划线
)
，以利于
与
SUMO
基因相连接，
P2
中含有
EcoR I
的酶切位点
(
下
划线
),
以利于与载体
pET28a(
＋
)
相连。
F1
：
5
’
-CGCGCGGCAGCCATATGGGTCATCACCATCA-3
’；
R1
：
5
’
-GCGCTTGTCTAACCTCCAATACCTTTTCGAAGCTTGG
；
↑
SUMO
蛋白酶的酶切位点
F 2
：
5
’
-GCTTCGAACCATGTTGCGCGCTGCCGCC-3
’；
R2
：
5
’
-GACGGAGCTCGAATTCCTATGAGTTCTTCTGAGGCA-3
’
将
His-SUMO
基因片段和
ALDH2
连接到克隆载
体
pMD19-T
中。将连接产物取
1 uL
热转化至
E. coli
Competent Cell JM109
中，涂布平板，
37
℃过夜培养。
挑取单菌落进行检测，筛选阳性克隆。构建的载体命
名为
pMD19-T-His-SUMO-ALDH2 (
图
7)
。送交
TaKaRa
公司进行测序。
图
7
克隆载体
pMD19-T-SUMO-ALDH2
的构建
Figure 7 Construction of plasmid vector pMD19- T-SUMOAL
DH2
3.3.2 pET28a-His-SUMO-ALDH2
表达载体的构建
pMD19-T-His-SUMO-ALDH2
测序成功后，构建
表达载体。利用空载
pET28a(
＋
)
上原有的
His
标签，
以及引物
F1
和
P2
，以
pMD19-T-His-SUMO-ALDH2
克隆载体为模板，使用
PrimeSTAR® HS DNA
Polymerase (Code No.DR010S)
扩增，切胶回收目的片
段。用
Nde I
与
EcoR I
将空载
pET28a(
＋
)
进行双酶切，
切胶回收目的片段。将上两种回收产物利用
T4 DNA
连接酶进行连接。结构图示如图
8
。
图
8
含有
SUMO-ALDH2
基因表达载体的构建
Figure 8 Schematic diagram of plasmid vector with the SUMO-
ALDH2 gene
将连接产物取
1 uL
热转化至
E. coli
Competent
Cell JM109
中，涂布平板，
37
℃过夜培养。挑取单菌
落进行检测，筛选阳性克隆。提取质粒命名为
pET28a-His-SUMO-ALDH2
。
3.4
目的基因的诱导表达
首先制备大肠杆菌感受态细胞，然后将含目的基
因质粒的转化至
BL21(DE3)plysS
感受态细胞中，在含
有
Kan
的
LB
平板上涂板，
37
℃ 培养
12 h
。菌体培养
后提取质粒并电泳、双酶切检测重组菌是否含有目的
基因条带。提取的质粒转化至表达菌株
BL21(DE3)
中。
在克隆菌株中挑取抗氨苄青霉素阳性克隆，提取质粒，
由大连宝生物生物技术有限公司测序鉴定。提取的质
粒使用
PrimeSTAR® HS DNA Polymerase (Code
No.DR010A)
，进行
PCR
扩增。
从平板上挑取重组菌单菌落接到含有
Kan
的
LB
培养基中，
37
℃摇床中
200 r/min
下过夜活化培养。将
活化好的重组菌按照
1%
的接种量接到新的含有
Kan
的
LB
培养基中，培养至
OD
600nm
=0.6
，加入
100 mol/L
的
IPTG (
终浓度为
1 mol/L)
，进行诱导，至
OD
600nm
=1.6
，
将培养的菌液在
9 000 r/min
下离心
10 min
，收取沉淀，
高压匀浆破碎后进行电泳。