基因组学与生物技术
(
网络版
), 2012
年
,
第
1
卷
,
第
7
篇
,
第
40
-
44
页
Jiyinzuxue Yu Shengwu Jishu (Online), 2012, Vol.1, No.7, 40
-
44
41
众所周知，苏云金芽孢杆菌
(
Bacillus thuringiensis
,
简称
Bt
)
的特征是能够在产生芽孢的同时伴随产生
伴孢晶体蛋白
(
parasporal crystal proteins)
，
也称为杀
虫晶体蛋白
(
insecticidal crystal proteins,
简称
ICPs)
。
绝大部分杀虫晶体蛋白
(
ICPs)
的表达依赖于芽孢形
成，即只有在芽孢形成期才会产生杀虫晶体蛋白
(
ICPs) (Liu et al., 2010; Liu et al., 2011)
。
但
Cry3Aa
是一个例外，
Cry3Aa
蛋白的表达发生在营养期并在
芽孢形成期结束
(
Schnepf et al., 1998)
。
研究表明，
cry3Aa
基因的启动子序列不同于其它
ICP
基因的启
动子，
cry3Aa
基因的转录依赖于细胞营养期特有的
ςA
因子。而其它
ICP
基因的表达必须得到芽孢形
成期
ςE
因子和
ςK
因子的激活才能进行
(
Schnepf et al.,
1998)
。
那么，是否可以利用
cry3Aa
基因的启动子
来驱动其它的
cry
基因表达杀虫晶体蛋白，从而实现
在苏云金芽孢杆菌的营养期表达伴孢晶体蛋白呢？
本研究试图设计一个能在苏云金芽孢杆菌的
营养期表达的杀虫晶体蛋白表达载体。为此，选用了
苏云金芽孢杆菌拟步虫甲亚种
(
Bt
subsp.
Tenebrions
,
Btt
)
的
DNA
作为模板，根据已知
cry3Aa
基因启动子设
计了一对引物
(
C3
-
5
和
C3
-
3)
，
利用
PCR
方法扩增
出了目的片段为
575
bp
的
DNA
片段，并将该片段
克隆到
pBU4
载体上建成一个
pBUC3
载体。随后，
我们将
cry1Ac31
基因连接到
pBUC3
载体中，最后，
将将含有
cry1Ac31
基因的表达载体通过电脉冲转
化法转入
Bt
无晶体突变株
IPS
，
通过
PCR
、
镜检和
SDS-PAGE
进行验证，为进一步开展多基因的表达
提供新的途径。
1
结果与分析
1.1
cry3Aa
启动子基因的获得
我们设计一对引物
C3
-
5/
C3
-
3
，
利用
Pfu
DNA
聚合酶，以
Btt
的
DNA
模板进行
PCR
扩增获得
575
bp
目的片段
(
图
1)
。
测序测定分析表明该片段的-
35
区
域
(
GATTAAGA)
存在于
402
bp
到
409
bp
之间，-
10
区
(
TATAAATT)
存在于
425
bp
到
433
bp
之间。转录
起始位点在
438
bp
处，
STAB-SD
序列
(
GAAAGGAGG)
在
443
bp
到
451
bp
之间。核糖体结合位点
(
RBS)
(
GAAAGGGAGG)
在
550
bp
到
560
bp
之间。获得的
启动子片段包含了完整的启动子结构域
(
图
2)
。
1.2
Bt
营养期表达载体
pBUC3
的构建
我们将获得的
575
bp
的启动子序列连接到
pBU4
载体上建成一个
pBUC3
载体。阳性克隆子经过
PCR
鉴定含有
575
bp
的启动子片段
(
图
3)
。
进一步用
Fok
Ⅰ
酶切阳性克隆发现
1
号克隆子酶切图谱与
Vector NTI
图
1
PCR
扩增获的启动子片段
注
:
M: 100 bp DNA Ladder; 1:
以
C3
-
5/
C3
-
3
为引物
PCR
扩
增
Btt
后生成的产物
Figure 1 The promoter fragment amplified by PCR
Note: M: 100 bp DNA Ladder; 1: The PCR product from Btt.
amplified by C3
-
5/
C3
-
3
primer
图
2
扩增的启动子序列及其结构域分析
Figure 2 Sequence analysis of the amplified promoter and its
domain structure
软件分析结果一致，出现了一条
526
bp
的特征条带
(
图
4)
。
最终测序结果验证了
1
号克隆子是符合本研
究设计目标的
Bt
营养期表达载体，将该克隆子命名
为
pBUC3
。
1.3
cry1Ac31
基因在
Bt
IPS
中的表达
我们将
cry1Ac31
基因连接到
pBUC3
载体上，
构建成
pBUC3
-
1
Ac31
，
通过电脉冲转化法转化
Bt
无晶体突变株
IPS
中。通过
PCR
扩增筛选阳性克隆
子，结果显示挑取的
3
个克隆子均出现了目的条带
(
图
5)
。
利用光学显微镜对
Bt
IPSC3
-
1
进行观察，
可以直观看出
IPSC3
-
1
已经能产生了大量菱形杀虫
晶体，而同时期的
Bt
S3299
-
1
以及
IPS
均无菱形晶
